Ανασκόπηση αρκετών τεχνικών μικροσκοπίας υπερ-ανάλυσης
Για τη συμβατική μικροσκοπία φωτός, η περίθλαση του φωτός περιορίζει την ανάλυση απεικόνισης σε περίπου 250 nm. Σήμερα, οι τεχνικές υπερ-ανάλυσης μπορούν να το βελτιώσουν κατά περισσότερο από έναν παράγοντα του 10. Αυτή η τεχνική επιτυγχάνεται κυρίως μέσω τριών μεθόδων: μικροσκοπία εντοπισμού ενός μορίου, συμπεριλαμβανομένης της φωτοευαίσθητης μικροσκοπίας εντοπισμού (PALM) και της στοχαστικής οπτικής μικροσκοπίας ανακατασκευής (STORM). δομημένο μικροσκόπιο φωτισμού (SIM); και μικροσκοπία εξάντλησης διεγερμένων εκπομπών (STED). Ο τρόπος επιλογής της τεχνολογίας υπερ-ανάλυσης είναι αυτό που ενδιαφέρει όλους. «Δυστυχώς, δεν υπάρχουν απλές αρχές για να αποφασίσετε ποια μέθοδο θα χρησιμοποιήσετε», λέει ο Mathew Stracy, μεταδιδακτορικός ερευνητής στο Πανεπιστήμιο της Οξφόρδης, στο Ηνωμένο Βασίλειο. «Το καθένα έχει τα δικά του πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα». Οι επιστήμονες φυσικά καταλαβαίνουν επίσης πώς να επιλέξουν τη σωστή μέθοδο για ένα συγκεκριμένο έργο. «Στο πλαίσιο της βιοαπεικόνισης, βασικοί παράγοντες που πρέπει να ληφθούν υπόψη περιλαμβάνουν: χωρική και χρονική ανάλυση, ευαισθησία σε φωτοφθορές, ικανότητα επισήμανσης, πάχος δείγματος και φθορισμός φόντου ή αυτόλογος φθορισμός κυττάρων». Πώς λειτουργεί Τα διάφορα μικροσκόπια υπερ-ανάλυσης λειτουργούν με διαφορετικούς τρόπους. Στην περίπτωση του PALM και του STORM, μόνο ένα μικρό κλάσμα δεικτών φθορισμού διεγείρεται ή φωτοενεργοποιείται σε μια δεδομένη στιγμή, επιτρέποντας τον ανεξάρτητο εντοπισμό τους με υψηλή ακρίβεια. Η διεξαγωγή αυτής της διαδικασίας με όλες τις φθορίζουσες ετικέτες έχει ως αποτέλεσμα μια πλήρη εικόνα υπερ-ανάλυσης. Ο Stefan Hell, ένας από τους νικητές του βραβείου Νόμπελ Χημείας 2014 και διευθυντής του Ινστιτούτου Βιοφυσικής Χημείας Max Planck, δήλωσε: «Το σύστημα PALM/STORM είναι σχετικά εύκολο στη δημιουργία, αλλά είναι δύσκολο να εφαρμοστεί, επειδή ο φθορισμός Η ομάδα πρέπει να έχει ικανότητα φωτοενεργοποίησης. Περιορισμοί Το μειονέκτημα είναι ότι πρέπει να ανιχνεύουν ένα μόνο φθορίζον μόριο στο πλαίσιο ενός κυττάρου και είναι λιγότερο αξιόπιστα από το STED." Το STED χρησιμοποιεί έναν παλμό λέιζερ για να διεγείρει το φθοροφόρο και ένα λέιζερ σε σχήμα δακτυλίου για να σβήσει το φθοροφόρο, αφήνοντας μόνο τον ενδιάμεσο φθορισμό μεγέθους νανομέτρων για υπερδιάκριση. Η σάρωση ολόκληρου του δείγματος παράγει μια εικόνα. «Το πλεονέκτημα του STED είναι ότι είναι μια τεχνολογία με κουμπιά», εξήγησε ο Hell. "Λειτουργεί σαν ένα τυπικό ομοεστιακό μικροσκόπιο φθορισμού." Μπορεί επίσης να απεικονίσει ζωντανά κύτταρα χρησιμοποιώντας φθοροφόρα όπως πράσινες ή κίτρινες φθορίζουσες πρωτεΐνες και βαφές που προέρχονται από ροδαμίνη. Παραμετρική σύγκριση Αν και όλες οι τεχνικές υπερ-ανάλυσης ξεπερνούν το συμβατικό μικροσκόπιο φωτός ως προς την ανάλυση, διαφέρουν μεταξύ τους. Η SIM διπλασιάζει περίπου την ανάλυση στα 100 nm περίπου. Το PALM και το STORM μπορούν να επιλύσουν στόχους 15 nm. Σύμφωνα με την Hell, το STED παρέχει χωρική ανάλυση 30 nm σε ζωντανά κύτταρα και 15 nm σε σταθερά κύτταρα. Όταν πρόκειται για συγκεκριμένες εφαρμογές, πρέπει να λάβουμε υπόψη και την αναλογία σήματος προς θόρυβο. Σε ορισμένες περιπτώσεις, χαμηλότερη ανάλυση αλλά υψηλότερο SNR μπορεί να οδηγήσει σε καλύτερη εικόνα από το αντίθετο (μεγαλύτερη ανάλυση αλλά χαμηλότερο SNR). Η ταχύτητα λήψης εικόνας είναι επίσης πολύ σημαντική, ειδικά για τα ζωντανά κύτταρα. «Όλες οι τεχνικές υπερ-ανάλυσης είναι πιο αργές από τις συμβατικές τεχνικές απεικόνισης φθορισμού», είπε ο Stracy. "Το PALM/STORM είναι το πιο αργό, χρειάζεται δεκάδες χιλιάδες καρέ για να αποκτήσει μία εικόνα, η SIM χρειάζεται δεκάδες καρέ και το STED είναι μια τεχνολογία σάρωσης, επομένως η ταχύτητα λήψης εξαρτάται από το μέγεθος του οπτικού πεδίου." Εκτός από ζωντανά κύτταρα ή σταθερά κύτταρα απεικόνισης, ορισμένοι επιστήμονες θέλουν επίσης να κατανοήσουν πώς κινούνται τα αντικείμενα. Ο Stracy ενδιαφέρεται να κατανοήσει τη δυναμική των βιολογικών συστημάτων στα ζωντανά κύτταρα, όχι μόνο τις στατικές εικόνες. Συνδυάζει το PALM με την παρακολούθηση μεμονωμένων σωματιδίων για να αναλύσει τη δυναμική σε ζωντανά κύτταρα. Με αυτόν τον τρόπο, μπορεί να παρακολουθεί απευθείας τα μόρια των δεικτών καθώς εκτελούν τις λειτουργίες τους. Ωστόσο, πιστεύει ότι η SIM δεν είναι κατάλληλη για τη μελέτη αυτών των δυναμικών διεργασιών σε μοριακό επίπεδο, αλλά λόγω της γρήγορης ταχύτητας πρόσκτησής της, είναι ιδιαίτερα κατάλληλη για την παρατήρηση της δυναμικής μεγαλύτερων δομών, όπως ολόκληρων χρωμοσωμάτων. Τα τελευταία αποτελέσματα Το 2017, η ομάδα της Hell ανέφερε το μικροσκόπιο υπερ-ανάλυσης MINFLUX στην Επιστήμη. Σύμφωνα με την Hell, αυτή η μέθοδος υπερ-ανάλυσης επιτυγχάνει χωρική ανάλυση 1 nm για πρώτη φορά. Επιπλέον, μπορεί να παρακολουθεί μεμονωμένα μόρια σε ζωντανά κύτταρα τουλάχιστον 100 φορές πιο γρήγορα από άλλες μεθόδους. Άλλοι επιστήμονες μίλησαν επίσης πολύ καλά για το μικροσκόπιο MINFLUX. «Νέες εφαρμογές και προσεγγίσεις αναπτύσσονται συνεχώς, αλλά δύο προόδους ξεχωρίζουν για μένα», είπε ο Shechtman. Το ένα είναι το MINFLUX. "Χρησιμοποιεί μια έξυπνη προσέγγιση για να πάρει πολύ ακριβή μοριακή τοποθέτηση." Όσον αφορά τη δεύτερη συναρπαστική εξέλιξη, ο Shechtman ανέφερε τον WE Moerner και τους συναδέλφους του στο Πανεπιστήμιο του Στάνφορντ. Ο Moerner ήταν επίσης αποδέκτης του Νόμπελ Χημείας 2014. Ένας από τους νικητές. Για να αντιμετωπίσουν τον περιορισμό της ανάλυσης απεικόνισης που προκαλείται από την ανισότροπη σκέδαση φθοριζόντων μεμονωμένων μορίων, οι επιστήμονες χρησιμοποίησαν διαφορετικές πολώσεις διέγερσης για να καθορίσουν τον προσανατολισμό και τη θέση των μορίων. Επιπλέον, έχουν αναπτύξει λεπτές επιφάνειες κόρης. Αυτές οι τεχνικές βελτιώνουν την ικανότητα εντοπισμού δομών. Σχετικά με τις ετικέτες φθορισμού Σε πολλές εφαρμογές υψηλής ανάλυσης, οι ετικέτες έχουν πραγματικά σημασία. Υπάρχουν επίσης ορισμένες εταιρείες που παρέχουν σχετικά προϊόντα. Για παράδειγμα, η γερμανική Miltenyi συνεργάστηκε με την Abberior, μια εταιρεία που ιδρύθηκε από τον Stefan Hell, για να παρέχει προσαρμοσμένες υπηρεσίες σύζευξης αντισωμάτων για βαφές μικροσκοπίας υπερ-ανάλυσης. Ορισμένες άλλες εταιρείες προσφέρουν επίσης αντίστοιχους δείκτες. «Οι νανο-ενισχυτές μας είναι πολύ μικροί, μόνο 1,5 kDa, και πολύ συγκεκριμένοι», λέει ο Christoph Eckert, υπεύθυνος μάρκετινγκ στη ChromoTek. Αυτές οι πρωτεΐνες δεσμεύουν πράσινες και κόκκινες φθορίζουσες πρωτεΐνες (GFP και RFP). Προέρχονται από θραύσματα αντισωμάτων αλπακά, γνωστά ως VHH ή νανοσώματα, με εξαιρετικές ιδιότητες δέσμευσης και σταθερή ποιότητα χωρίς διακύμανση από παρτίδα σε παρτίδα. Αυτοί οι δείκτες είναι κατάλληλοι για διάφορες τεχνικές υπερ-ανάλυσης, συμπεριλαμβανομένων των SIM, PALM, STORM και STED. Ο Ai-Hui Tang, επίκουρος καθηγητής στο Πανεπιστήμιο του Maryland School of Medicine, και οι συνεργάτες του χρησιμοποίησαν το GFP-Booster και το STORM της ChromoTek για να εξερευνήσουν τη διάδοση πληροφοριών στο νευρικό σύστημα. Βρήκαν μοριακά νανοσύστημα, που ονομάζονται νανοστήλες, σε προσυναπτικούς και μετασυναπτικούς νευρώνες. Οι επιστήμονες πιστεύουν ότι αυτή η δομή δείχνει ότι το κεντρικό νευρικό σύστημα χρησιμοποιεί απλές αρχές για τη διατήρηση και τη ρύθμιση της συναπτικής αποτελεσματικότητας. Διάφορες εκδόσεις απεικόνισης υπερ-ανάλυσης και ένας αυξανόμενος αριθμός μεθόδων οδηγούν τους επιστήμονες ακόμη πιο βαθιά στα βιολογικά μυστήρια. Σπάζοντας το όριο περίθλασης του ορατού φωτός, οι βιολόγοι μπορούν ακόμη και να «παρακολουθούν στενά» τις ενέργειες των κυττάρων.
