Διαφορά μεταξύ μικροσκοπίου φθορισμού και κανονικού μικροσκοπίου
1. Κοιτάξτε τη μέθοδο φωτισμού
Η μέθοδος φωτισμού του μικροσκοπίου φθορισμού είναι γενικά τύπου epi, δηλαδή η πηγή φωτός τοποθετείται στο δείγμα δοκιμής μέσω του αντικειμενικού φακού.
2. Δείτε το ψήφισμα
Τα μικροσκόπια φθορισμού χρησιμοποιούν το υπεριώδες φως ως πηγή φωτός, με σχετικά μικρό μήκος κύματος, αλλά η ανάλυση είναι υψηλότερη από αυτή των συνηθισμένων οπτικών μικροσκοπίων.
3, η διαφορά στο φίλτρο
Το μικροσκόπιο φθορισμού χρησιμοποιεί δύο ειδικά φίλτρα, που χρησιμοποιούνται μπροστά από την πηγή φωτός για να φιλτράρουν το ορατό φως και χρησιμοποιούνται μεταξύ του αντικειμενικού φακού και του προσοφθάλμιου φακού για να φιλτράρουν το υπεριώδες φως, το οποίο μπορεί να προστατεύσει τα ανθρώπινα μάτια.
Το μικροσκόπιο φθορισμού είναι επίσης ένας τύπος οπτικού μικροσκοπίου, κυρίως επειδή το μήκος κύματος που διεγείρεται από το μικροσκόπιο φθορισμού είναι μικρό, επομένως αυτό οδηγεί στη διαφορά στη δομή και τη χρήση του μικροσκοπίου φθορισμού και του συνηθισμένου μικροσκοπίου. Τα περισσότερα από τα μικροσκόπια φθορισμού έχουν καλή λειτουργία σύλληψης ασθενούς φωτός. , επομένως υπό εξαιρετικά αδύναμο φθορισμό, η ικανότητα απεικόνισης είναι επίσης καλή. Σε συνδυασμό με τη συνεχή βελτίωση της μικροσκοπίας φθορισμού τα τελευταία χρόνια, ο θόρυβος έχει επίσης μειωθεί σημαντικά. Ως εκ τούτου, χρησιμοποιούνται όλο και περισσότερα μικροσκόπια φθορισμού.
Γνώση Μικροσκοπίας Φθορισμού Δύο Φωτονίων
Η βασική αρχή της διέγερσης με δύο φωτόνια είναι: στην περίπτωση υψηλής πυκνότητας φωτονίων, τα φθορίζοντα μόρια μπορούν να απορροφήσουν δύο φωτόνια μεγάλου μήκους κύματος ταυτόχρονα και μετά από μια πολύ σύντομη διάρκεια ζωής της λεγόμενης διεγερμένης κατάστασης, εκπέμπουν ένα φωτόνιο μικρού μήκους κύματος ; το αποτέλεσμα είναι το ίδιο με τη χρήση ενός φωτονίου με μήκος κύματος το μισό του μεγάλου μήκους κύματος για να διεγείρει ένα φθορίζον μόριο. Η διέγερση δύο φωτονίων απαιτεί υψηλή πυκνότητα φωτονίων και για να μην βλάψει τα κύτταρα, η μικροσκοπία δύο φωτονίων χρησιμοποιεί παλμικά λέιζερ κλειδωμένης λειτουργίας υψηλής ενέργειας. Αυτό το λέιζερ εκπέμπει φως λέιζερ με υψηλή ενέργεια αιχμής και χαμηλή μέση ενέργεια, με πλάτος παλμού μόνο 100 femtoseconds και συχνότητα 80 έως 100 MHz. Όταν χρησιμοποιείται ένας αντικειμενικός φακός υψηλού αριθμού διαφράγματος για την εστίαση των φωτονίων του παλμικού λέιζερ, η πυκνότητα φωτονίων στο εστιακό σημείο του αντικειμενικού φακού είναι η υψηλότερη και η διέγερση δύο φωτονίων εμφανίζεται μόνο στο εστιακό σημείο του αντικειμενικού φακού, Έτσι, το μικροσκόπιο δύο φωτονίων δεν χρειάζεται ομοεστιακή οπή καρφίτσας, η οποία βελτιώνει την απόδοση ανίχνευσης φθορισμού.
Στο γενικό φαινόμενο φθορισμού, λόγω της χαμηλής πυκνότητας φωτονίων του φωτός διέγερσης, ένα φθορίζον μόριο μπορεί να απορροφήσει μόνο ένα φωτόνιο ταυτόχρονα και στη συνέχεια να εκπέμψει ένα φωτόνιο φθορισμού μέσω της μετάβασης ακτινοβολίας, η οποία ονομάζεται φθορισμός ενός φωτονίου. Για τη διαδικασία διέγερσης φθορισμού με λέιζερ ως πηγή φωτός, μπορεί να εμφανιστεί φαινόμενο φθορισμού δύο φωτονίων ή ακόμη και πολλών φωτονίων. Αυτή τη στιγμή, η ένταση της πηγής φωτός διέγερσης που χρησιμοποιείται είναι υψηλή και η πυκνότητα φωτονίων ικανοποιεί την απαίτηση ότι το φθορίζον μόριο απορροφά δύο φωτόνια ταυτόχρονα. Στη διαδικασία χρήσης ενός γενικού λέιζερ ως πηγής φωτός διέγερσης, η πυκνότητα των φωτονίων εξακολουθεί να μην είναι αρκετή για να παράγει απορρόφηση δύο φωτονίων. Συνήθως, χρησιμοποιείται ένα παλμικό λέιζερ femtosecond και η στιγμιαία ισχύς του μπορεί να φτάσει την τάξη των μεγαβάτ. Επομένως, το μήκος κύματος του φθορισμού δύο φωτονίων είναι μικρότερο από το μήκος κύματος του φωτός διέγερσης, το οποίο είναι ισοδύναμο με το φαινόμενο που παράγεται από τη διέγερση μήκους κύματος μισής διέγερσης.
Η μικροσκοπία φθορισμού δύο φωτονίων έχει πολλά πλεονεκτήματα:
1) Το φως μεγάλου μήκους κύματος επηρεάζεται λιγότερο από τη σκέδαση από το φως μικρού μήκους κύματος και μπορεί εύκολα να διεισδύσει στο δείγμα.
2) Τα φθορίζοντα μόρια έξω από το εστιακό επίπεδο δεν διεγείρονται, έτσι ώστε περισσότερο φως διέγερσης να μπορεί να φτάσει στο εστιακό επίπεδο, έτσι ώστε το φως διέγερσης να μπορεί να διεισδύσει σε βαθύτερα δείγματα.
3) Το φως μεγάλου μήκους κύματος κοντά στο υπέρυθρο είναι λιγότερο τοξικό για τα κύτταρα από το φως μικρού μήκους κύματος.
4) Κατά την προβολή δειγμάτων με μικροσκοπία δύο φωτονίων, η φωτολεύκανση και η φωτοτοξικότητα υπάρχουν μόνο στο εστιακό επίπεδο. Ως εκ τούτου, η μικροσκοπία δύο φωτονίων είναι πιο κατάλληλη για την προβολή παχύρρευστων δειγμάτων από τη μικροσκοπία ενός φωτονίου, για την προβολή ζωντανών κυττάρων ή για την εκτέλεση πειραμάτων φωτολεύκανσης σταθερού σημείου.
Γνώση ομοεστιακής μικροσκοπίας φθορισμού
Η βασική αρχή της ομοεστιακής μικροσκοπίας φθορισμού: χρησιμοποιώντας μια σημειακή πηγή φωτός για να φωτίσει το δείγμα, σχηματίζεται ένα μικρό φωτεινό σημείο με καλά καθορισμένο περίγραμμα στο εστιακό επίπεδο. αποτελείται από τον διαχωριστή δέσμης. Ο διαχωριστής δέσμης στέλνει τον φθορισμό απευθείας στον ανιχνευτή. Υπάρχει μια οπή καρφίτσας μπροστά από την πηγή φωτός και τον ανιχνευτή, που ονομάζονται αντίστοιχα pinhole φωτισμού και pinhole ανίχνευσης. Οι γεωμετρικές διαστάσεις των δύο είναι ίδιες, περίπου 100-200 nm. σε σχέση με το φωτεινό σημείο στο εστιακό επίπεδο, τα δύο είναι συζευγμένα, δηλαδή, το φωτεινό σημείο διέρχεται από μια σειρά φακών και, τέλος, μπορεί να εστιαστεί στην οπή φωτισμού και στην οπή ανίχνευσης ταυτόχρονα. Με αυτόν τον τρόπο, το φως από το εστιακό επίπεδο μπορεί να συγκεντρωθεί εντός του εύρους της οπής ανίχνευσης, ενώ το σκεδαζόμενο φως από πάνω ή κάτω από το εστιακό επίπεδο αποκλείεται από την οπή ανίχνευσης και δεν μπορεί να απεικονιστεί. Το δείγμα σαρώνεται σημείο προς σημείο με το λέιζερ και ο σωλήνας φωτοπολλαπλασιαστή μετά την ανίχνευση της οπής λαμβάνει επίσης την ομοεστιακή εικόνα του αντίστοιχου φωτός σημείο προς σημείο, το οποίο μετατρέπεται σε ψηφιακό σήμα και μεταδίδεται στον υπολογιστή και τελικά συγκεντρώνεται την οθόνη σε μια καθαρή ομοεστιακή εικόνα ολόκληρου του εστιακού επιπέδου. .
Κάθε εικόνα εστιακού επιπέδου είναι στην πραγματικότητα μια οπτική διατομή του δείγματος και αυτή η οπτική διατομή έχει πάντα ένα ορισμένο πάχος, γνωστό και ως οπτική τομή. Δεδομένου ότι η ένταση φωτός στο εστιακό σημείο είναι πολύ μεγαλύτερη από εκείνη στο μη εστιακό σημείο και το μη εστιακό επίπεδο φως φιλτράρεται από την οπή καρφίτσας, το βάθος πεδίου του ομοεστιακού συστήματος είναι περίπου μηδέν και η σάρωση κατά μήκος του Ο άξονας Z μπορεί να πραγματοποιήσει οπτική τομογραφία, σχηματίζοντας το Observe ένα δισδιάστατο οπτικό τμήμα στο εστιασμένο σημείο του δείγματος. Συνδυάζοντας τη σάρωση επιπέδου XY (εστιακό επίπεδο) με τη σάρωση του άξονα Z (οπτικός άξονας), με τη συσσώρευση δισδιάστατων εικόνων διαδοχικών στρωμάτων και την επεξεργασία από ειδικό λογισμικό υπολογιστή, μπορεί να ληφθεί μια τρισδιάστατη εικόνα του δείγματος.
Δηλαδή, η οπή ανίχνευσης και η οπή της πηγής φωτός εστιάζονται πάντα στο ίδιο σημείο, έτσι ώστε ο φθορισμός που διεγείρεται έξω από το επίπεδο εστίασης να μην μπορεί να εισέλθει στην οπή ανίχνευσης.
Η απλή έκφραση της αρχής λειτουργίας του ομοεστιακού λέιζερ είναι ότι χρησιμοποιεί ένα λέιζερ ως πηγή φωτός και με βάση την παραδοσιακή απεικόνιση μικροσκοπίου φθορισμού, συνδέεται μια συσκευή σάρωσης λέιζερ και μια συζευγμένη συσκευή εστίασης και η λήψη και επεξεργασία ψηφιακής εικόνας το σύστημα ελέγχεται από υπολογιστή.
