Πώς να επιλέξετε το κατάλληλο μικροσκόπιο φθορισμού
Το μικροσκόπιο φθορισμού είναι ένας τυπικός εξοπλισμός μικροσκοπικής απεικόνισης σε εργαστήρια και παθολογικά τμήματα, ο οποίος χρησιμοποιεί χαρακτηριστικά φθορισμού για παρατήρηση και απεικόνιση. Χρησιμοποιείται ευρέως σε διάφορους τομείς όπως η κυτταρική βιολογία, η νευροβιολογία, η βοτανική, η μικροβιολογία, η παθολογία, η γενετική κ.λπ. Η απεικόνιση φθορισμού έχει τα πλεονεκτήματα της υψηλής ευαισθησίας και ειδικότητας, καθιστώντας την πολύ κατάλληλη για την παρατήρηση της κατανομής συγκεκριμένων πρωτεϊνών, οργανιδίων κ.λπ. Σε ιστούς και κύτταρα, μελέτη εντοπισμού και αλληλεπιδράσεων, παρακολούθηση δυναμικών διεργασιών της ζωής, όπως αλλαγές συγκέντρωσης ιόντων και ούτω καθεξής.
Επιλογή μικροσκοπίων
Τα μικροσκόπια φθορισμού χωρίζονται κυρίως σε τρεις κατηγορίες: όρθια μικροσκόπια φθορισμού (κατάλληλα για τεμαχισμό), μικροσκόπια ανεστραμμένου φθορισμού (κατάλληλα για ζωντανά κύτταρα και επίσης για τεμαχισμό) και στερεοσκοπικά μικροσκόπια φθορισμού (κατάλληλα για μεγαλύτερα δείγματα, φυτά/ψάρια, όπως π.χ. εμβρυϊκό), μέδακα, όργανα ποντικού/ποντικού κ.λπ.).
Επιλογή μπλοκ φίλτρων φθορισμού
Η επιλογή των μπλοκ φίλτρου δεν θα πρέπει να λαμβάνει υπόψη μόνο τα μήκη κύματος διέγερσης και εκπομπής των ανιχνευτών φθορισμού, αλλά επίσης να εξετάζει εάν υπάρχει μη ειδική διέγερση και εάν υπάρχει έγχρωμη αλληλεπίδραση για δείγματα με πολύχρωμη ετικέτα. Στο πείραμα, θα επιλέξουμε το μήκος κύματος που είναι πλησιέστερο στην κορυφή διέγερσης όσο το δυνατόν περισσότερο για διέγερση και το εύρος λήψης θα πρέπει να περιλαμβάνει την εκπομπή κορυφής. Η κορυφή διέγερσης του Alexa Fluor 488 είναι 500 nm και ένα φίλτρο διέγερσης 480/40 μπορεί να επιλεγεί σε μικροσκόπιο φθορισμού. Τα συνήθως χρησιμοποιούμενα μπλοκ φίλτρου φθορισμού στη μικροσκοπία φθορισμού μπορούν να χωριστούν σε δύο τύπους: μακροπερατό (LP) και διέλευση ζώνης (BP), τα οποία επίσης πρέπει να επιλέγονται ανάλογα με τις ανάγκες.
Συνεστιακό μικροσκόπιο
Στις παραδοσιακές παρατηρήσεις μικροσκοπίας φθορισμού, λόγω της επικάλυψης ουσιών με σήμανση φθορισμού και αυθόρμητων δομών φθορισμού, συνδέονται στενά μεταξύ τους. Ωστόσο, οι παραδοσιακοί στόχοι μικροσκοπίας φθορισμού πτώσεως όχι μόνο συλλέγουν φως από το εστιακό επίπεδο, αλλά και διασκορπίζουν το φως πάνω-κάτω στο εστιακό επίπεδο, με αποτέλεσμα σημαντική μείωση στην ανάλυση και την αντίθεση της εικόνας.
Η ομοεστιακή απεικόνιση ανιχνεύει μόνο το φως που ανακλάται από το επίπεδο αυτοεστίασης, επιλύοντας έτσι το παραπάνω πρόβλημα. Η πηγή φωτός σχηματίζει ένα μικρό και λεπτό σημείο στο εστιακό επίπεδο μέσω μιας οπής καρφίτσας και το φως που εκπέμπεται από το εστιακό επίπεδο συλλέγεται μέσω του αντικειμενικού φακού. Η πλειονότητα του φθορισμού που εκπέμπεται από σημεία πάνω ή κάτω από το εστιακό επίπεδο του αντικειμενικού φακού δεν μπορεί να συγκλίνει στην οπή. Μόνο ο φθορισμός που βρίσκεται στο εστιακό επίπεδο και ένα μικρό μέρος του αποεστιασμένου φθορισμού μπορούν να περάσουν μέσα από την οπή καρφίτσας, ενώ η φωτεινή δέσμη έξω από το εστιακό επίπεδο συγκλίνει μπροστά ή πίσω από την πλάκα της οπής καρφίτσας και εμποδίζεται να εισέλθει στον ανιχνευτή μέσω της οπής καρφίτσας. Η εικόνα που ανιχνεύεται είναι από το εστιακό επίπεδο, επομένως η τελική ποιότητα της εικόνας βελτιώνεται σημαντικά.
Λόγω των διαφόρων πλεονεκτημάτων και της πρακτικότητας της ομοεστιακής μικροσκοπίας σάρωσης με λέιζερ, είναι επί του παρόντος ένας απαραίτητος πειραματικός βοηθός σε πεδία κυτταρικής βιολογίας, βοτανικής και κυτταρικής έρευνας υψηλής ακρίβειας. Ταυτόχρονα, στα μελλοντικά επιστημονικά ερευνητικά κέντρα θα είναι το βασικότερο και βασικότερο ερευνητικό εργαλείο.
