Η κύρια μέθοδος παρατήρησης του οπτικού μικροσκοπίου είναι η παρατήρηση φθορισμού
Ο φθορισμός αναφέρεται στη διαδικασία κατά την οποία μια φθορίζουσα ουσία εκπέμπει φως με μεγαλύτερο μήκος κύματος σχεδόν ταυτόχρονα όταν ακτινοβολείται με φως συγκεκριμένου μήκους κύματος (Εικόνα 1). Όταν φως συγκεκριμένου μήκους κύματος (μήκος κύματος διέγερσης) προσπίπτει σε ένα μόριο, όπως αυτά σε ένα φθοροφόρο, η ενέργεια των φωτονίων απορροφάται από τα ηλεκτρόνια του μορίου. Στη συνέχεια, τα ηλεκτρόνια μεταβαίνουν από τη θεμελιώδη κατάσταση (S0) σε ένα υψηλότερο ενεργειακό επίπεδο, τη διεγερμένη κατάσταση (S1'). Αυτή η διαδικασία ονομάζεται διέγερση①. Το ηλεκτρόνιο παραμένει σε διεγερμένη κατάσταση για 10-9–10-8 δευτερόλεπτα, κατά τη διάρκεια των οποίων το ηλεκτρόνιο χάνει κάποια ενέργεια②. Κατά τη διαδικασία των ηλεκτρονίων που εγκαταλείπουν τη διεγερμένη κατάσταση (S1) και επιστρέφουν στη θεμελιώδη κατάσταση③, η υπόλοιπη ενέργεια που απορροφάται κατά τη διαδικασία διέγερσης απελευθερώνεται.
Ο χρόνος παραμονής του φθορίζοντος μορίου στη διεγερμένη κατάσταση είναι ο χρόνος ζωής του φθορισμού, ο οποίος είναι γενικά στο επίπεδο νανοδευτερόλεπτο και είναι ένα εγγενές χαρακτηριστικό του ίδιου του φθορίζοντος μορίου. Το Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM), το οποίο χρησιμοποιεί τεχνολογία απεικόνισης διάρκειας ζωής φθορισμού, ονομάζεται fluorescence lifetime imaging (FLIM). Εκτός από την απεικόνιση έντασης φθορισμού, μπορούν να ληφθούν πιο σε βάθος λειτουργικές και ακριβείς μετρήσεις για να ληφθεί μοριακή διαμόρφωση, διαμοριακές αλληλεπιδράσεις και το μικροπεριβάλλον των μορίων. Πληροφορίες που είναι δύσκολο να ληφθούν με τη συμβατική οπτική απεικόνιση.
Μια άλλη σημαντική ιδιότητα του φθορισμού είναι η μετατόπιση Stokes, η διαφορά στο μήκος κύματος μεταξύ των κορυφών διέγερσης και εκπομπής (Εικόνα 2). Τυπικά το μήκος κύματος εκπομπής είναι μεγαλύτερο από το μήκος κύματος διέγερσης. Αυτό συμβαίνει επειδή τα ηλεκτρόνια θα χάσουν μέρος της ενέργειάς τους μέσω της διαδικασίας χαλάρωσης μετά τη διέγερση της φθορίζουσας ουσίας και πριν απελευθερώσουν φωτόνια. Οι φθορίζουσες ουσίες με μεγαλύτερες μετατοπίσεις Stokes είναι ευκολότερο να παρατηρηθούν κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού.
Μικροσκοπία φθορισμού και Κύβοι φίλτρου φθορισμού
Το μικροσκόπιο φθορισμού είναι ένα οπτικό μικροσκόπιο που χρησιμοποιεί ιδιότητες φθορισμού για παρατήρηση και απεικόνιση και χρησιμοποιείται ευρέως σε διάφορους τομείς όπως η κυτταρική βιολογία, η νευροβιολογία, η βοτανική, η μικροβιολογία, η παθολογία και η γενετική. Η απεικόνιση φθορισμού έχει τα πλεονεκτήματα της υψηλής ευαισθησίας και της υψηλής εξειδίκευσης και είναι πολύ κατάλληλη για την παρατήρηση της κατανομής συγκεκριμένων πρωτεϊνών και οργανιδίων σε ιστούς και κύτταρα, τη μελέτη του εντοπισμού και της αλληλεπίδρασης, την παρακολούθηση δυναμικών διεργασιών της ζωής, όπως οι αλλαγές συγκέντρωσης ιόντων , και τα λοιπά.
Τα περισσότερα μόρια στα κύτταρα δεν φθορίζουν και για να τα δούμε πρέπει να φέρουν σήμανση φθορισμού. Υπάρχουν πολλές μέθοδοι σήμανσης με φθορισμό, όπως η άμεση επισήμανση (όπως η χρήση DAPI για την επισήμανση του DNA) ή η ανοσοχρώση χρησιμοποιώντας τις ιδιότητες δέσμευσης αντιγόνου των αντισωμάτων ή η χρήση φθοριζουσών πρωτεϊνών (όπως GFP, πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη) για την επισήμανση πρωτεϊνών-στόχων , και αναστρέψιμη δέσμευση. Συνθετικές βαφές (όπως Fura-2) και ούτω καθεξής.
Προς το παρόν, το μικροσκόπιο φθορισμού έχει γίνει ο τυπικός εξοπλισμός απεικόνισης διαφόρων εργαστηρίων και πλατφορμών απεικόνισης και είναι ένας καλός βοηθός για τα καθημερινά μας πειράματα. Τα μικροσκόπια φθορισμού χωρίζονται κυρίως σε τρεις κατηγορίες: όρθια μικροσκόπια φθορισμού (κατάλληλα για τεμαχισμό), μικροσκόπια ανεστραμμένου φθορισμού (κατάλληλα για ζωντανά κύτταρα, λαμβανομένου υπόψη του τεμαχισμού), στερεοσκόπια φθορισμού (κατάλληλα για μεγαλύτερα δείγματα, όπως φυτά ζέβρα/ψάρια, ), medaka, όργανα ποντικιού/ποντικού, κ.λπ.).
Το μπλοκ φίλτρου φθορισμού είναι το βασικό συστατικό της απεικόνισης φθορισμού μικροσκοπίου. Αποτελείται από τρία μέρη: φίλτρο διέγερσης, φίλτρο εκπομπής και διχρωμία διαχωριστή δέσμης. Τοποθετείται στον τροχό του φίλτρου. Για παράδειγμα, το Leica DMi8 είναι εξοπλισμένο με 6-τροχό φίλτρου θέσης (Εικ. 3 ). Ο αριθμός των θέσεων των διαφορετικών τροχών μικροσκοπίου θα είναι διαφορετικός και ορισμένα μικροσκόπια χρησιμοποιούν πλάκες μπλοκ φίλτρου.
Το μπλοκ φίλτρου παίζει σημαντικό ρόλο στην απεικόνιση φθορισμού: το φίλτρο διέγερσης επιλέγει το φως διέγερσης για να διεγείρει το δείγμα και αποκλείει το φως άλλων μηκών κύματος. το φως που διέρχεται από το φίλτρο διέγερσης διέρχεται από το διχρωμικό κάτοπτρο (η λειτουργία του είναι να αντανακλά το φως διέγερσης και να μεταδίδει τον φθορισμό), μετά την ανάκλαση, εστιάζεται από τον αντικειμενικό φακό, ακτινοβολεί το δείγμα και διεγείρει τον αντίστοιχο φθορισμό, δηλαδή , εξέπεμπε φως. Το εκπεμπόμενο φως συλλέγεται από τον αντικειμενικό φακό, διέρχεται από τον διαχωριστή διχρωμίας δέσμης και φτάνει στο φίλτρο εκπομπής. Όπως φαίνεται στο σχήμα 4: το μήκος κύματος διέγερσης είναι 450-490nm, το διχρωμικό κάτοπτρο αντανακλά φως μικρότερο από 510 nm, μεταδίδει φως μεγαλύτερο από 510 nm και το εύρος λήψης του εκπεμπόμενου φωτός είναι 520-560nm.
