Η μικροσκοπία φθορισμού διαφέρει από τη συμβατική μικροσκοπία
Τα μικροσκόπια φθορισμού χρησιμοποιούν υπεριώδες φως ως πηγή φωτός για να ακτινοβολήσουν το αντικείμενο που πρόκειται να επιθεωρηθεί, έτσι ώστε το αντικείμενο να εκπέμπει φως και, στη συνέχεια, να παρατηρήσει το αντικείμενο κάτω από το μικροσκόπιο. Χρησιμοποιείται κυρίως για κύτταρα ανοσοφθορισμού. Αποτελείται κυρίως από μια πηγή φωτός, ένα σύστημα πλάκας φίλτρου και ένα οπτικό σύστημα για την παρατήρηση της φθορίζουσας εικόνας του δείγματος μέσω της μεγέθυνσης του προσοφθάλμιου φακού και του αντικειμενικού φακού. Ας ρίξουμε μια ματιά στη διαφορά μεταξύ αυτού του μικροσκοπίου φθορισμού και ενός συνηθισμένου οπτικού μικροσκοπίου.
1. Κοιτάξτε τη μέθοδο φωτισμού
Η μέθοδος φωτισμού του μικροσκοπίου φθορισμού είναι γενικά επισκοπική, δηλαδή η φωτεινή πηγή προβάλλεται στο δείγμα δοκιμής μέσω του αντικειμενικού φακού.
2. Δείτε το ψήφισμα
Τα μικροσκόπια φθορισμού χρησιμοποιούν το υπεριώδες φως ως πηγή φωτός και το μήκος κύματος είναι σχετικά μικρό, αλλά η ανάλυση είναι υψηλότερη από αυτή των συνηθισμένων οπτικών μικροσκοπίων.
3. Η διαφορά στο φίλτρο
Τα μικροσκόπια φθορισμού χρησιμοποιούν δύο ειδικά φίλτρα, τα οποία χρησιμοποιούνται μπροστά από την πηγή φωτός για να φιλτράρουν το ορατό φως και χρησιμοποιούνται μεταξύ του αντικειμενικού φακού και του προσοφθάλμιου φακού για να φιλτράρουν τις υπεριώδεις ακτίνες, οι οποίες μπορούν να προστατεύσουν τα ανθρώπινα μάτια.
Το μικροσκόπιο φθορισμού είναι επίσης ένα είδος οπτικού μικροσκοπίου, κυρίως επειδή το μήκος κύματος που διεγείρεται από το μικροσκόπιο φθορισμού είναι μικρό, επομένως αυτό οδηγεί στη διαφορά στη δομή και τη χρήση μεταξύ του μικροσκοπίου φθορισμού και του συνηθισμένου μικροσκοπίου. Τα περισσότερα από τα μικροσκόπια φθορισμού έχουν καλή λειτουργία σύλληψης ασθενούς φωτός, επομένως υπό εξαιρετικά αδύναμο φθορισμό, η ικανότητα απεικόνισης είναι επίσης καλή. Σε συνδυασμό με τη συνεχή βελτίωση των μικροσκοπίων φθορισμού τα τελευταία χρόνια, ο θόρυβος έχει επίσης μειωθεί σημαντικά. Επομένως χρησιμοποιούνται όλο και περισσότερα μικροσκόπια φθορισμού.
ζεύγος
Γνώσεις σχετικά με τη μικροσκοπία φθορισμού φωτονίων
Η βασική αρχή της διέγερσης με δύο φωτόνια είναι: στην περίπτωση υψηλής πυκνότητας φωτονίων, τα φθορίζοντα μόρια μπορούν να απορροφήσουν δύο φωτόνια μεγάλου μήκους κύματος ταυτόχρονα και να εκπέμπουν ένα φωτόνιο μικρότερου μήκους κύματος μετά από μια σύντομη διάρκεια ζωής της λεγόμενης διεγερμένης κατάστασης. το αποτέλεσμα είναι το ίδιο με τη χρήση ενός φωτονίου με μήκος κύματος το ήμισυ του μεγάλου μήκους κύματος για να διεγείρει τα φθορίζοντα μόρια. Η διέγερση με δύο φωτόνια απαιτεί υψηλή πυκνότητα φωτονίων. Για να μην βλάψει τα κύτταρα, το μικροσκόπιο δύο φωτονίων χρησιμοποιεί παλμικά λέιζερ με κλειδωμένη λειτουργία υψηλής ενέργειας. Το λέιζερ που εκπέμπεται από αυτό το λέιζερ έχει υψηλή ενέργεια αιχμής και χαμηλή μέση ενέργεια, το πλάτος του παλμού του είναι μόνο 100 femtoseconds και η συχνότητά του μπορεί να φτάσει τα 80 έως 100 megahertz. Όταν χρησιμοποιείται ένας αντικειμενικός φακός υψηλού αριθμητικού διαφράγματος για την εστίαση των φωτονίων του παλμικού λέιζερ, η πυκνότητα φωτονίων στο εστιακό σημείο του αντικειμενικού φακού είναι η υψηλότερη και η διέγερση δύο φωτονίων εμφανίζεται μόνο στο εστιακό σημείο του αντικειμενικού φακού. Το μικροσκόπιο δύο φωτονίων δεν απαιτεί ομοεστιακή οπή, η οποία βελτιώνει την απόδοση ανίχνευσης φθορισμού.
Σε γενικά φαινόμενα φθορισμού, λόγω της χαμηλής πυκνότητας φωτονίων του φωτός διέγερσης, ένα φθορίζον μόριο μπορεί να απορροφήσει μόνο ένα φωτόνιο ταυτόχρονα και στη συνέχεια να εκπέμψει ένα φωτόνιο φθορισμού μέσω μιας ακτινοβολίας μετάβασης, που είναι φθορισμός ενός φωτονίου. Για τη διαδικασία διέγερσης φθορισμού χρησιμοποιώντας λέιζερ ως πηγή φωτός, μπορεί να εμφανιστεί φθορισμός δύο φωτονίων ή ακόμη και πολλαπλών φωτονίων. Αυτή τη στιγμή, η ένταση της πηγής φωτός διέγερσης που χρησιμοποιείται είναι υψηλή και η πυκνότητα των φωτονίων ικανοποιεί τις απαιτήσεις των μορίων φθορισμού που απορροφούν δύο φωτόνια ταυτόχρονα. Στη διαδικασία χρήσης ενός γενικού λέιζερ ως πηγή φωτός διέγερσης, η πυκνότητα των φωτονίων εξακολουθεί να μην είναι αρκετή για να προκαλέσει το φαινόμενο της απορρόφησης δύο φωτονίων. Συνήθως, χρησιμοποιείται ένα παλμικό λέιζερ femtosecond και η στιγμιαία ισχύς του μπορεί να φτάσει την τάξη των μεγαβάτ. Επομένως, το μήκος κύματος του φθορισμού δύο φωτονίων είναι μικρότερο από το μήκος κύματος του φωτός διέγερσης, το οποίο είναι ισοδύναμο με το φαινόμενο που παράγεται από τη διέγερση στο μισό του μήκους κύματος διέγερσης.
Η μικροσκοπία φθορισμού δύο φωτονίων έχει πολλά πλεονεκτήματα:
1) Το φως μεγάλου μήκους κύματος επηρεάζεται λιγότερο από τη σκέδαση από το φως μικρού μήκους κύματος και διεισδύει εύκολα στο δείγμα.
2) Τα φθορίζοντα μόρια έξω από το εστιακό επίπεδο δεν διεγείρονται, έτσι ώστε περισσότερο φως διέγερσης να μπορεί να φτάσει στο εστιακό επίπεδο, έτσι ώστε το φως διέγερσης να μπορεί να διεισδύσει σε βαθύτερα δείγματα.
3) Το φως μεγάλου μήκους κύματος κοντά στο υπέρυθρο είναι λιγότερο τοξικό για τα κύτταρα από το φως μικρού μήκους κύματος.
4) Όταν χρησιμοποιείτε μικροσκόπιο δύο φωτονίων για την παρατήρηση δειγμάτων, η φωτολεύκανση και η φωτοτοξικότητα εμφανίζονται μόνο στο εστιακό επίπεδο. Επομένως, το μικροσκόπιο δύο φωτονίων είναι πιο κατάλληλο από το μικροσκόπιο ενός φωτονίου για την παρατήρηση παχύρρευστων δειγμάτων, για την παρατήρηση ζωντανών κυττάρων ή για πειράματα φωτολεύκανσης κηλίδων.
Γνώσεις σχετικά με την ομοεστιακή μικροσκοπία φθορισμού
Η βασική αρχή της ομοεστιακής μικροσκοπίας φθορισμού: το δείγμα ακτινοβολείται από μια σημειακή πηγή φωτός και μια μικρή, καλά καθορισμένη φωτεινή κηλίδα σχηματίζεται στο εστιακό επίπεδο. Αφού ακτινοβοληθεί το σημείο, ο φθορισμός που εκπέμπεται συλλέγεται από τον αντικειμενικό φακό και αποστέλλεται πίσω στον διαχωριστή δέσμης που αποτελείται από ένα διχρωμικό κάτοπτρο κατά μήκος της αρχικής διαδρομής φωτισμού. Ο διαχωριστής δέσμης στέλνει τον φθορισμό απευθείας στον ανιχνευτή. Υπάρχει μια οπή καρφίτσας μπροστά από την πηγή φωτός και τον ανιχνευτή, που ονομάζονται αντίστοιχα pinhole φωτισμού και pinhole ανίχνευσης. Το γεωμετρικό μέγεθος των δύο είναι το ίδιο, περίπου 100-200nm; σε σχέση με το φωτεινό σημείο στο εστιακό επίπεδο, τα δύο είναι συζευγμένα, δηλαδή, το φωτεινό σημείο διέρχεται από μια σειρά φακών και, τέλος, μπορεί να εστιαστεί στην οπή φωτισμού και στην οπή ανίχνευσης ταυτόχρονα. Με αυτόν τον τρόπο, το φως από το εστιακό επίπεδο μπορεί να συγκλίνει εντός του εύρους της οπής ανίχνευσης, ενώ το σκεδαζόμενο φως από πάνω ή κάτω από το εστιακό επίπεδο μπλοκάρεται έξω από την οπή ανίχνευσης και δεν μπορεί να απεικονιστεί. Το λέιζερ σαρώνει το δείγμα σημείο προς σημείο και ο σωλήνας φωτοπολλαπλασιαστή αφού ανιχνεύσει την οπή λαμβάνει επίσης την ομοεστιακή εικόνα του αντίστοιχου φωτός σημείο προς σημείο, το οποίο μετατρέπεται σε ψηφιακό σήμα και μεταδίδεται στον υπολογιστή και τελικά συγκεντρώνεται σε ένα διαυγές ομοεστιακή εικόνα ολόκληρου του εστιακού επιπέδου στην οθόνη.
Κάθε εικόνα εστιακού επιπέδου είναι στην πραγματικότητα μια οπτική διατομή του δείγματος και αυτή η οπτική διατομή έχει πάντα ένα ορισμένο πάχος, γνωστό και ως οπτική λεπτή τομή. Δεδομένου ότι η ένταση φωτός στο εστιακό σημείο είναι πολύ μεγαλύτερη από εκείνη στο σημείο μη εστίασης και το μη εστιακό επίπεδο φως φιλτράρεται από την οπή καρφίτσας, το βάθος πεδίου του ομοεστιακού συστήματος είναι περίπου μηδέν και η σάρωση κατά μήκος του Ο άξονας Z μπορεί να πραγματοποιήσει οπτική τομογραφία, σχηματίζοντας μια δισδιάστατη οπτική τομή στο εστιασμένο σημείο του δείγματος που θα παρατηρηθεί. Συνδυάζοντας τη σάρωση επιπέδου XY (εστιακό επίπεδο) με τη σάρωση με άξονα Z (οπτικός άξονας), η τρισδιάστατη εικόνα του δείγματος μπορεί να ληφθεί με τη συσσώρευση δισδιάστατων εικόνων συνεχών στρωμάτων και να υποβληθεί σε επεξεργασία από ειδικό λογισμικό υπολογιστή.
Δηλαδή, η οπή ανίχνευσης και η οπή της πηγής φωτός εστιάζονται πάντα στο ίδιο σημείο, έτσι ώστε ο φθορισμός που διεγείρεται έξω από το εστιακό επίπεδο να μην μπορεί να εισέλθει στην οπή ανίχνευσης.
Η απλή έκφραση της αρχής λειτουργίας του συνεστιακού λέιζερ είναι ότι χρησιμοποιεί το φως λέιζερ ως πηγή φωτός. Με βάση την παραδοσιακή απεικόνιση μικροσκοπίου φθορισμού, προσθέτει μια συσκευή σάρωσης λέιζερ και μια συζευγμένη συσκευή εστίασης και είναι ένα σύστημα λήψης και επεξεργασίας ψηφιακής εικόνας μέσω ελέγχου υπολογιστή.
