Πώς διαφέρει η μικροσκοπία φθορισμού από τη συμβατική μικροσκοπία
Πρόσφατα προσπάθησα να φτιάξω μερικά κατεψυγμένα τμήματα ποντικών και τώρα πρέπει να χρησιμοποιήσω ένα μικροσκόπιο φθορισμού για να δω αν ο ιός που έκανα ένεση βρίσκεται στην επιθυμητή περιοχή του εγκεφάλου. Μερικές βασικές αρχές της μικροσκοπίας φθορισμού πρέπει να μελετηθούν εν συντομία, και θα τις μοιραστώ επίσης εδώ.
Το μικροσκόπιο φθορισμού χρησιμοποιεί το υπεριώδες φως ως πηγή φωτός για να φωτίσει το αντικείμενο που εξετάζεται, προκαλώντας το αντικείμενο να εκπέμπει μια πηγή φωτός και, στη συνέχεια, να παρατηρήσει το αντικείμενο κάτω από το μικροσκόπιο. Χρησιμοποιείται κυρίως για κύτταρα ανοσοφθορισμού, αποτελείται από πηγή φωτός, σύστημα πλάκας φίλτρου και οπτικό σύστημα για την παρατήρηση της εικόνας φθορισμού του δείγματος μέσω της μεγέθυνσης του προσοφθάλμιου φακού και του αντικειμενικού φακού. Ας ρίξουμε μια ματιά στη διαφορά μεταξύ αυτού του μικροσκοπίου φθορισμού και ενός κανονικού οπτικού μικροσκοπίου.
1. Ως προς τις μεθόδους φωτισμού
Η μέθοδος φωτισμού ενός μικροσκοπίου φθορισμού χρησιμοποιεί γενικά μια μέθοδο πτώσης δέσμης, που σημαίνει ότι η πηγή φωτός προβάλλεται στο δείγμα δοκιμής μέσω του αντικειμενικού φακού.
2. Ως προς την επίλυση
Το μικροσκόπιο φθορισμού χρησιμοποιεί το υπεριώδες φως ως πηγή φωτός, με σχετικά μικρό μήκος κύματος αλλά υψηλότερη ανάλυση από τα συνηθισμένα οπτικά μικροσκόπια.
3. Διαφορές στο φίλτρο
Ένα μικροσκόπιο φθορισμού χρησιμοποιεί δύο ειδικά φίλτρα, ένα μπροστά από την πηγή φωτός για να φιλτράρει το ορατό φως και το άλλο μεταξύ του αντικειμενικού φακού και του προσοφθάλμιου φακού για να φιλτράρει το υπεριώδες φως, το οποίο μπορεί να προστατεύσει τα μάτια.
Το μικροσκόπιο φθορισμού είναι επίσης ένας τύπος οπτικού μικροσκοπίου, κυρίως επειδή το μήκος κύματος που διεγείρεται από τη μικροσκοπία φθορισμού είναι μικρό, γεγονός που οδηγεί σε διαφορές στη δομή και τη χρήση του μικροσκοπίου φθορισμού και της συνηθισμένης μικροσκοπίας. Τα περισσότερα μικροσκόπια φθορισμού έχουν καλή λειτουργία σύλληψης ασθενούς φωτός, επομένως η ικανότητα απεικόνισης τους είναι επίσης καλή υπό εξαιρετικά αδύναμο φθορισμό. Επιπλέον, με τη συνεχή βελτίωση της μικροσκοπίας φθορισμού τα τελευταία χρόνια, ο θόρυβος έχει επίσης μειωθεί σημαντικά. Ως εκ τούτου, όλο και περισσότερα μικροσκόπια φθορισμού εφαρμόζονται.
Γνώσεις σχετικές με τη μικροσκοπία φθορισμού δύο φωτονίων
Η βασική αρχή της διέγερσης με δύο φωτόνια είναι ότι σε υψηλή πυκνότητα φωτονίων, τα φθορίζοντα μόρια μπορούν ταυτόχρονα να απορροφήσουν δύο φωτόνια μεγάλου μήκους κύματος και μετά από μια σύντομη περίοδο ζωής της λεγόμενης διεγερμένης κατάστασης, να εκπέμπουν ένα φωτόνιο μικρότερου μήκους κύματος. Η επίδρασή του είναι ίδια με τη χρήση ενός φωτονίου με μήκος κύματος ίσο με το μισό μήκος κύματος για να διεγείρει φθορίζοντα μόρια. Η διέγερση δύο φωτονίων απαιτεί υψηλή πυκνότητα φωτονίων και για να αποφευχθεί η καταστροφή των κυττάρων, χρησιμοποιείται παλμικό λέιζερ με κλειδωμένη λειτουργία υψηλής ενέργειας σε μικροσκόπιο δύο φωτονίων. Το λέιζερ που εκπέμπεται από αυτόν τον τύπο λέιζερ έχει υψηλή ενέργεια αιχμής και χαμηλή μέση ενέργεια, με πλάτος παλμού μόνο 100 femtoseconds και συχνότητα έως και 80 έως 100 megahertz. Όταν χρησιμοποιείται ένας αντικειμενικός φακός υψηλού αριθμητικού διαφράγματος για την εστίαση των φωτονίων ενός παλμικού λέιζερ, η πυκνότητα φωτονίων στο εστιακό σημείο του αντικειμενικού φακού είναι η υψηλότερη και η διέγερση δύο φωτονίων εμφανίζεται μόνο στο εστιακό σημείο του αντικειμενικού φακού. Επομένως, ένα μικροσκόπιο δύο φωτονίων δεν απαιτεί ομοεστιακές οπές καρφίτσας, γεγονός που βελτιώνει την αποτελεσματικότητα της ανίχνευσης φθορισμού.
Σε γενικά φαινόμενα φθορισμού, λόγω της χαμηλής πυκνότητας φωτονίων διέγερσης, ένα φθορίζον μόριο μπορεί να απορροφήσει μόνο ένα φωτόνιο ταυτόχρονα και στη συνέχεια να εκπέμψει ένα φωτόνιο φθορισμού μέσω της μετάβασης ακτινοβολίας, που ονομάζεται φθορισμός μονού φωτονίου. Για τη διαδικασία διέγερσης φθορισμού χρησιμοποιώντας λέιζερ ως πηγή φωτός, μπορεί να εμφανιστούν φαινόμενα φθορισμού δύο φωτονίων ή ακόμη και πολυφωτονίων. Αυτή τη στιγμή, η πηγή φωτός διέγερσης που χρησιμοποιείται είναι υψηλής έντασης και η πυκνότητα φωτονίων ικανοποιεί την απαίτηση για τα φθορίζοντα μόρια να απορροφούν δύο φωτόνια ταυτόχρονα. Στη διαδικασία χρήσης ενός τυπικού λέιζερ ως πηγή φωτός διέγερσης, η πυκνότητα των φωτονίων εξακολουθεί να μην είναι επαρκής για να δημιουργήσει φαινόμενο απορρόφησης δύο φωτονίων. Συνήθως, χρησιμοποιούνται παλμικά λέιζερ femtosecond και η στιγμιαία ισχύς τους μπορεί να φτάσει το επίπεδο των μεγαβάτ. Ως εκ τούτου, το μήκος κύματος του φθορισμού δύο φωτονίων είναι μικρότερο από αυτό της διέγερσης, το οποίο είναι ισοδύναμο με το αποτέλεσμα που παράγεται από τη διέγερση του μισού μήκους κύματος διέγερσης.
