Εισαγωγή στη μικροσκοπία φθορισμού
Το μικροσκόπιο φθορισμού είναι η ακτινοβολία του αντικειμένου που έχει χρωματιστεί με φλουορεσκεΐνη με φως μικρού μήκους κύματος, έτσι ώστε να διεγείρεται να παράγει φθορισμό μεγάλου μήκους κύματος και στη συνέχεια να παρατηρείται. Σε ένα μικροσκόπιο φθορισμού, το φως διέγερσης ενός συγκεκριμένου μήκους κύματος πρέπει να επιλεγεί από το φως φωτισμού του δείγματος για να δημιουργήσει φθορισμό και, στη συνέχεια, ο φθορισμός πρέπει να διαχωριστεί από το μικτό φως του φωτός διέγερσης και του φθορισμού για παρατήρηση. Επομένως, το σύστημα φίλτρου παίζει εξαιρετικά σημαντικό ρόλο στην επιλογή ενός συγκεκριμένου μήκους κύματος. Τα μικροσκόπια φθορισμού χρησιμοποιούνται ευρέως στη βιολογία, την ιατρική και άλλους τομείς.
1. Τα κύρια συστατικά του μικροσκοπίου φθορισμού:
(Α) Πηγή φωτός: Η φωτεινή πηγή ακτινοβολεί φως διαφόρων μηκών κύματος (από υπεριώδες έως υπέρυθρο). ο
(Β) Πηγή φωτός φίλτρου διέγερσης: μέσω του φωτός ενός συγκεκριμένου μήκους κύματος που μπορεί να προκαλέσει το δείγμα να παράγει φθορισμό, ενώ εμποδίζει το φως που είναι άχρηστο για συναρπαστικό φθορισμό. ο
(Γ) Δείγματα φθορισμού: γενικά χρωματίζονται με φθορίζουσες χρωστικές. ο
(Δ) Φίλτρο αποκλεισμού: μπλοκάρει το φως διέγερσης που δεν απορροφάται από το δείγμα και εκπέμπει επιλεκτικά τον φθορισμό και ορισμένα μήκη κύματος μεταδίδονται επιλεκτικά στον φθορισμό.
ο
2. Ταξινόμηση μικροσκοπίων φθορισμού:
Τα μικροσκόπια φθορισμού χωρίζονται γενικά σε δύο τύπους: μετάδοση και επι-εκπομπή:
ένα. Τύπος μετάδοσης: το φως διέγερσης προέρχεται από το κάτω μέρος του προς επιθεώρηση αντικειμένου και ο συμπυκνωτής είναι συμπυκνωτής σκοτεινού πεδίου, έτσι ώστε το φως διέγερσης να μην εισέρχεται στον αντικειμενικό φακό, αλλά ο φθορισμός να εισέρχεται στον αντικειμενικό φακό. Είναι φωτεινό σε χαμηλές μεγεθύνσεις, αλλά σκοτεινό σε μεγάλες μεγεθύνσεις. Είναι δύσκολο να λειτουργήσει σε βύθιση λαδιού και κεντράρισμα. Είναι ιδιαίτερα δύσκολο να προσδιοριστεί το εύρος φωτισμού σε χαμηλές μεγεθύνσεις, αλλά μπορεί να αποκτήσει ένα πολύ σκοτεινό φόντο οπτικού πεδίου. Ο τύπος μετάδοσης δεν χρησιμοποιείται για αδιαφανή αντικείμενα. ο
σι. Epi-type: Ο τύπος μετάδοσης έχει σχεδόν εξαλειφθεί επί του παρόντος. Τα περισσότερα από τα νέα μικροσκόπια φθορισμού είναι τύπου epi. Η πηγή φωτός προέρχεται από πάνω από το αντικείμενο που πρόκειται να επιθεωρηθεί και υπάρχει ένας διαχωριστής δέσμης στην οπτική διαδρομή, επομένως είναι κατάλληλος τόσο για διαφανή όσο και για αδιαφανή αντικείμενα προς επιθεώρηση. Δεδομένου ότι ο αντικειμενικός φακός λειτουργεί ως φακός συμπυκνωτή, δεν είναι μόνο εύκολος στη χρήση του, αλλά μπορεί επίσης να επιτύχει ομοιόμορφο φωτισμό ολόκληρου του οπτικού πεδίου από χαμηλή έως υψηλή μεγέθυνση. ο
ο
3. Προφυλάξεις για ακτινοσκόπηση
ένα. Η μακροχρόνια ακτινοβολία του φωτός διέγερσης θα προκαλέσει εξασθένηση και σβήσιμο του φθορισμού, επομένως συντομεύστε όσο το δυνατόν περισσότερο τον χρόνο παρατήρησης και χρησιμοποιήστε ένα διάφραγμα για να καλύψετε το φως διέγερσης όταν δεν παρατηρείτε προσωρινά. ο
σι. Όταν παρατηρείτε με φακό εμβάπτισης λαδιού, χρησιμοποιήστε "μη φθορίζον λάδι". ο
ντο. Ο φθορισμός είναι σχεδόν πάντα ασθενής και πρέπει να πραγματοποιείται σε σκοτεινό δωμάτιο. ο
ρε. Είναι καλύτερο να εγκαταστήσετε έναν σταθεροποιητή τάσης στο τροφοδοτικό, διαφορετικά η ασταθής τάση όχι μόνο θα μειώσει τη διάρκεια ζωής της λάμπας υδραργύρου, αλλά θα επηρεάσει και την επίδραση της επιθεώρησης με μικροσκόπιο. ο
ο
4. Χρήση μικροσκοπίας φθορισμού
1. Απαιτήσεις προετοιμασίας για δείγματα μικροσκοπίου φθορισμού
ένα. Γυάλινη διαφάνεια
Το πάχος της γυάλινης διαφάνειας πρέπει να είναι μεταξύ 0,8 και 1,2 mm. Μια διαφάνεια που είναι πολύ παχιά θα απορροφήσει περισσότερο φως αφενός και, αφετέρου, το φως διέγερσης δεν μπορεί να συγκεντρωθεί στο δείγμα. Οι πλάκες πρέπει να είναι λείες, ομοιόμορφες σε πάχος και απαλλαγμένες από εμφανή αυτοφθορισμό. Μερικές φορές χρησιμοποιούνται τσουλήθρες από γυαλί χαλαζία. ο
σι. Γυαλί κάλυψης
Το πάχος του γυαλιού καλύμματος είναι περίπου 0.17 mm, λείο. Προκειμένου να ενισχυθεί το φως διέγερσης, μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί ένα ξηρό γυαλί κάλυψης, το οποίο είναι ένα ειδικό γυαλί καλύμματος επικαλυμμένο με πολλά στρώματα ουσιών (όπως το φθοριούχο μαγνήσιο) που έχουν διαφορετικές επιδράσεις παρεμβολής στο φως διαφορετικών μηκών κύματος, το οποίο μπορεί να κάνει ο φθορισμός πάει ομαλά. Το φως διέγερσης διέρχεται και το ανακλώμενο φως διέγερσης διεγείρει το δείγμα. ο
ντο. Δείγμα
Οι φέτες ιστού ή άλλα δείγματα δεν πρέπει να είναι πολύ παχιά. Εάν είναι πολύ παχύ, το μεγαλύτερο μέρος του φωτός διέγερσης θα καταναλωθεί στο κάτω μέρος του δείγματος, ενώ το πάνω μέρος που παρατηρείται άμεσα από τον αντικειμενικό φακό δεν μπορεί να διεγερθεί πλήρως. Επιπλέον, η επικάλυψη κυττάρων ή οι ακαθαρσίες καλύπτονται, επηρεάζοντας την κρίση. ο
ρε. Πράκτορας τοποθέτησης
Η γλυκερίνη χρησιμοποιείται συνήθως ως μέσο στερέωσης, το οποίο δεν πρέπει να έχει αυτοφθορισμό, άχρωμο και διαφανές και η φωτεινότητα του φθορισμού είναι πιο φωτεινή σε pH 8.5-9.5 και δεν είναι εύκολο να εξασθενίσει γρήγορα. Ως εκ τούτου, ένα ίσο μίγμα γλυκερίνης και ρυθμιστικού διαλύματος ανθρακικού 0,5 mol/L με pH 9.0 έως 9,5 χρησιμοποιείται συνήθως ως παράγοντας στερέωσης. ο
μι. λάδι καθρέφτη
Γενικά, το λάδι εμβάπτισης πρέπει να χρησιμοποιείται κατά την παρατήρηση δειγμάτων με μικροσκόπια φθορισμού σκοτεινού πεδίου και στόχους εμβάπτισης με εμβάπτιση λαδιού. Είναι καλύτερο να χρησιμοποιείτε ειδικό μη φθορίζον λάδι καθρέφτη, το οποίο μπορεί επίσης να αντικατασταθεί από την προαναφερθείσα γλυκερίνη και μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί υγρή παραφίνη, αλλά ο δείκτης διάθλασης είναι χαμηλός, γεγονός που επηρεάζει ελαφρώς την ποιότητα της εικόνας.
