Συνεστιακό μικροσκόπιο λέιζερ Χαρακτηριστικά και εφαρμογές
Ενώ σε ένα κανονικό μικροσκόπιο το επίπεδο εικόνας της παρατήρησης απομονώνεται από τα γειτονικά αξονικά επίπεδα επικαλύπτοντας το εστιακό επίπεδο του αντικειμενικού φακού με τον ανιχνευτή, σε ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο αυτή η απομόνωση επιτυγχάνεται φωτίζοντας το δείγμα με ένα σημείο περιορισμένης περίθλασης φως και φιλτράροντας το αδέσποτο φως χρησιμοποιώντας μια τρύπα καρφίτσας στη διαδρομή του συλλεγόμενου φωτός στη συζευγμένη εστία αυτού του σημείου φωτός για να επιτευχθεί αυτή η απομόνωση και έτσι να βελτιωθεί η ανάλυση.
Μόνο το φως που ανακλάται πίσω από το συζευγμένο στρώμα δείγματος μπορεί να περάσει μέσα από την οπή καρφίτσας στη διαδρομή φωτός συλλογής, ενώ οι υπόλοιπες άσχετες ανακλάσεις του στρώματος δείγματος εμποδίζονται από την οπή καρφίτσας. Αυτό δίνει μια σημαντική αύξηση στην ανάλυση. Παρακάτω φαίνεται μια παράπλευρη σύγκριση πολυδιάστατης μικροσκοπίας φθορισμού και ομοεστιακής μικροσκοπίας του ίδιου παχύ δείγματος. Όταν μια σειρά εικόνων λαμβάνεται σε διαφορετικά εστιακά επίπεδα, παράγεται μια εικόνα που συνήθως αναφέρεται ως "στοίβα z", η οποία δείχνει τα κέρδη ανάλυσης και αντίθεσης που παρέχονται από την ομοεστιακή μικροσκοπία και τους υποκείμενους λόγους για αυτά τα κέρδη. Μπορεί να φανεί ότι η εξέταση της εικόνας στην κορυφή της στοίβας όπου το επίπεδο απεικόνισης είναι πάνω από τον ιστό αποκαλύπτει μεγάλη ποσότητα διάσπαρτου φωτός στην εικόνα φθορισμού, ενώ η εικόνα του ομοεστιακού μικροσκοπίου εμφανίζεται μαύρη. Αυτή η μείωση του PSF στην αξονική κατεύθυνση συμβάλλει άμεσα στη διαφορά στην ανάλυση που παρατηρείται στην οπτική διεπαφή στο μέσο της στοίβας z.
Απεικόνιση σάρωσης οπτικής τομής
Ένα άλλο χαρακτηριστικό της ομοεστιακής μικροσκοπίας σάρωσης με λέιζερ είναι ότι είναι μια τεχνική απεικόνισης σάρωσης. Οι παραδοσιακές τεχνικές φωτισμού ευρέος πεδίου φωτίζουν ολόκληρο το δείγμα έτσι ώστε η εικόνα να μπορεί να ληφθεί απευθείας με γυμνό μάτι ή ανιχνευτή, αλλά το LSCM χρησιμοποιεί μία ή περισσότερες εστιασμένες δέσμες φωτός για να σαρώσει το δείγμα, έτσι ώστε η εικόνα που προκύπτει να ονομάζεται οπτική τομή, όπως φαίνεται στο παρακάτω διάγραμμα. Η διαφορά μεταξύ του παραδοσιακού φωτισμού ευρέος πεδίου και του ομοεστιακού φωτισμού σάρωσης λέιζερ φαίνεται παρακάτω.
Επομένως, ένας πρακτικός τρόπος σύγχρονης ομοεστιακής μικροσκοπίας φαίνεται στο παρακάτω σχήμα. Το φως διέγερσης από το λέιζερ διέρχεται μέσω ενός διχρωικού καθρέφτη και σαρώνεται μέσω ενός ζεύγους κατόπτρων γαλβανομέτρου στην κατεύθυνση x και y του δείγματος, και η διέγερση (ή ανάκλαση) του δείγματος περνά μέσα από μια τρύπα καρφίτσας στο PMT ο ανιχνευτής που πρόκειται να καταγραφεί και η εγγεγραμμένη σαρωμένη εικόνα ανακατασκευάζεται από έναν υπολογιστή για να παραχθεί μια πραγματική εικόνα του δείγματος.
