Laser Confocal Microscopy - Χαρακτηριστικά και Εφαρμογές
Η ομοεστιακή μικροσκοπία σάρωσης λέιζερ (LSCM) είναι ένας τύπος μικροσκοπίου που έχει σχεδιαστεί με βάση την τεχνολογία συζευγμένης εστίασης, δηλαδή η πηγή φωτός λέιζερ, το δείγμα προς μέτρηση και ο ανιχνευτής βρίσκονται όλα σε συζευγμένες θέσεις μεταξύ τους.
Θεμελιώδης
Σε ένα γενικό μικροσκόπιο, το επίπεδο εικόνας παρατήρησης απομονώνεται από το παρακείμενο αξονικό επίπεδο συμπίπτοντας το εστιακό επίπεδο του αντικειμενικού φακού με τον ανιχνευτή, ενώ σε ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο χρησιμοποιείται ένα σημείο φωτός περιορισμένης περίθλασης για να φωτίσει το δείγμα και το Α. pinhole χρησιμοποιείται στη συλλεγόμενη διαδρομή φωτός στη συζευγμένη εστία του φωτεινού σημείου για να φιλτράρει το αδέσποτο φως για να δημιουργήσει αυτό το εφέ απομόνωσης και έτσι να βελτιώσει την ανάλυση.
Χαρακτηριστικά απεικόνισης
Απεικόνιση σάρωσης οπτικού τμήματος
Ένα άλλο χαρακτηριστικό της ομοεστιακής μικροσκοπίας σάρωσης λέιζερ είναι ότι είναι μια τεχνολογία απεικόνισης σάρωσης. Η παραδοσιακή τεχνολογία φωτισμού ευρέος πεδίου φωτίζει ολόκληρο το δείγμα, επομένως η εικόνα μπορεί να ληφθεί απευθείας με γυμνό μάτι ή έναν ανιχνευτή, αλλά το LSCM χρησιμοποιεί μια δέσμη ή πολλαπλές εστιασμένες δέσμες περνούν μέσα από το δείγμα για σάρωση και εικόνα. Η εικόνα που προκύπτει ονομάζεται οπτικό τμήμα. Το παρακάτω δείχνει τη διαφορά μεταξύ της παραδοσιακής μεθόδου φωτισμού ευρέος πεδίου και της μεθόδου ομοεστιακού φωτισμού σάρωσης με λέιζερ.
Επομένως, μια πραγματική μέθοδος εργασίας ενός σύγχρονου ομοεστιακού μικροσκοπίου είναι όπως φαίνεται στο παρακάτω σχήμα. Το φως διέγερσης που εκπέμπεται από το λέιζερ διέρχεται από ένα διχρωμικό κάτοπτρο και σαρώνεται προς την κατεύθυνση x και y του δείγματος μέσω ενός ζεύγους γαλβανομέτρων. Η διέγερση (ή η ανάκλαση) του δείγματος είναι Το φως εισέρχεται στον ανιχνευτή PMT μέσω της οπής καρφίτσας και καταγράφεται, και η εγγεγραμμένη σαρωμένη εικόνα ανακατασκευάζεται από έναν υπολογιστή για να ανακατασκευαστεί η πραγματική εικόνα δείγματος.
Δημιουργήστε εικόνες "z-stack" σε διαφορετικά εστιακά επίπεδα
Μόνο το φως που ανακλάται πίσω από το συζευγμένο στρώμα δείγματος μπορεί να περάσει μέσα από τη μικρή οπή στη διαδρομή φωτός συλλογής και οι υπόλοιπες άσχετες αντανακλάσεις του στρώματος δείγματος μπλοκάρονται από τη μικρή οπή. Αυτό μπορεί να οδηγήσει σε σημαντικές βελτιώσεις στην ανάλυση. Σύγκριση δίπλα-δίπλα πολυδιάστατης μικροσκοπίας φθορισμού και ομοεστιακής μικροσκοπίας του ίδιου παχύ δείγματος. Όταν λαμβάνεται μια σειρά εικόνων σε διαφορετικά εστιακά επίπεδα, μπορούν να δημιουργηθούν εικόνες που συνήθως αναφέρονται ως "στίβες z", οι οποίες απεικονίζουν τα κέρδη ανάλυσης και αντίθεσης που προσφέρει η ομοεστιακή μικροσκοπία και τις υποκείμενες αιτίες αυτών των κερδών. Μπορεί να φανεί ότι η εξέταση της εικόνας στην κορυφή της στοίβας με το επίπεδο απεικόνισης πάνω από τον ιστό αποκαλύπτει μεγάλη ποσότητα διάσπαρτου φωτός στην εικόνα φθορισμού, ενώ η εικόνα της ομοεστιακής μικροσκοπίας εμφανίζεται μαύρη. Αυτή η μείωση του αξονικού PSF οδηγεί άμεσα στη διαφορά ανάλυσης που παρατηρείται στην οπτική διεπαφή στο μέσο της στοίβας z.
Η ανάλυση είναι πολύ βελτιωμένη σε σύγκριση με τον φωτισμό ευρείας περιοχής
Στη μικροσκοπία φθορισμού, η ένταση φωτός που εκπέμπεται από ένα μόνο σημείο περιγράφεται από τη συνάρτηση διασποράς σημείου (PSF) και το μοτίβο της είναι ένας Αέρινος δίσκος. Η ανάλυση του συστήματος φθορισμού μπορεί να περιγραφεί από την ακτίνα του Airy δίσκου, η οποία μπορεί να περιγραφεί από Το αριθμητικό άνοιγμα του αντικειμενικού φακού και το μήκος κύματος του φωτός διέγερσης καθορίζουν
