Ταξινόμηση μικροσκοπίας και αρχή λειτουργίας για την κυτταρική έρευνα
Το μικροσκόπιο είναι το κύριο εργαλείο για την παρατήρηση των κυττάρων. Σύμφωνα με διαφορετικές πηγές φωτός, μπορεί να χωριστεί σε δύο κατηγορίες: οπτικά μικροσκόπια και ηλεκτρονικά μικροσκόπια. Το πρώτο χρησιμοποιεί ορατό φως (τα μικροσκόπια UV χρησιμοποιούν υπεριώδες φως) ως πηγή φωτός, ενώ το δεύτερο χρησιμοποιεί δέσμες ηλεκτρονίων ως πηγή φωτός.
-,Οπτικό μικροσκόπιο
(1) Συνηθισμένο οπτικό μικροσκόπιο
Τα συνηθισμένα βιολογικά μικροσκόπια αποτελούνται από τρία μέρη, και συγκεκριμένα: ① σύστημα φωτισμού, συμπεριλαμβανομένης της πηγής φωτός και του συμπυκνωτή. ② οπτικό σύστημα μεγέθυνσης, που αποτελείται από αντικειμενικό φακό και προσοφθάλμιο, το οποίο είναι το κύριο σώμα του μικροσκοπίου. Προκειμένου να εξαλειφθεί η σφαιρική και η χρωματική εκτροπή, τόσο ο προσοφθάλμιος όσο και ο αντικειμενικός φακός ③Μηχανική συσκευή, που χρησιμοποιείται για τη στερέωση του υλικού και τη διευκόλυνση της παρατήρησης (Εικόνα 2-1).
Το αν η εικόνα του μικροσκοπίου είναι καθαρή δεν καθορίζεται μόνο από τη μεγέθυνση, αλλά σχετίζεται και με την ανάλυση του μικροσκοπίου. Η ανάλυση αναφέρεται στην ικανότητα του μικροσκοπίου (ή του ανθρώπινου ματιού να απέχει 25 cm από τον στόχο) να διακρίνει τη μικρότερη απόσταση μεταξύ των αντικειμένων. Το μέγεθος της ανάλυσης καθορίζεται από το μήκος κύματος και η αναλογία ανοίγματος του φωτός και ο δείκτης διάθλασης του μέσου εκφράζονται με τον τύπο:
Στον τύπο: n=δείκτης διάθλασης του μέσου.=γωνία διαφράγματος (η γωνία ανοίγματος του δείγματος προς το διάφραγμα του αντικειμενικού φακού), διάφραγμα φακού NA=(αριθμητικό διάφραγμα). Η γωνία του φακού είναι πάντα μικρότερη από 180 μοίρες, επομένως η μέγιστη τιμή του sina/2 πρέπει να είναι μικρότερη από 1.
Ο δείκτης διάθλασης του γυαλιού που χρησιμοποιείται για την κατασκευή του οπτικού φακού είναι 1,65 έως 1,78 και ο δείκτης διάθλασης του μέσου που χρησιμοποιείται είναι πιο κοντά στο γυαλί, τόσο το καλύτερο. Για ξηρούς αντικειμενικούς φακούς, το μέσο είναι ο αέρας και η αναλογία διαφράγματος του φακού είναι γενικά 0.05 έως 0,95; για φακούς λαδιού, το λάδι κέδρου χρησιμοποιείται ως μέσο και η αναλογία διαφράγματος του φακού μπορεί να είναι κοντά στο 1,5.
Το μήκος κύματος του συνηθισμένου φωτός είναι {{0}}nm, επομένως η τιμή ανάλυσης του μικροσκοπίου δεν θα είναι μικρότερη από 0,2μm και η ανάλυση του ανθρώπινου ματιού είναι 0,2 mm, οπότε η Η μέγιστη μεγέθυνση του γενικού σχεδιασμού μικροσκοπίου είναι συνήθως 1000Χ.
(2) Μικροσκόπιο φθορισμού
Ορισμένες ουσίες στα κύτταρα, όπως η χλωροφύλλη, μπορούν να φθορίσουν αφού ακτινοβοληθούν από τις υπεριώδεις ακτίνες. ορισμένες ουσίες οι ίδιες δεν μπορούν να φθορίσουν, αλλά εάν χρωματιστούν με φθορίζουσες βαφές ή φθορίζοντα αντισώματα, μπορούν επίσης να φθορίσουν όταν ακτινοβοληθούν από υπεριώδεις ακτίνες και το μικροσκόπιο φθορισμού (Εικ. 2-2, 3, 4) είναι ένα από τα εργαλεία. για ποιοτική και ποσοτική έρευνα σε τέτοιες ουσίες.
Τα μικροσκόπια φθορισμού και τα συνηθισμένα μικροσκόπια έχουν τις ακόλουθες διαφορές:
1. Η μέθοδος φωτισμού είναι συνήθως επι-φωτισμός, δηλαδή η πηγή φωτός προβάλλεται στο δείγμα μέσω του αντικειμενικού φακού (Εικόνα 2-3).
2. Η πηγή φωτός είναι το υπεριώδες φως, το μήκος κύματος είναι μικρότερο και η ανάλυση είναι υψηλότερη από αυτή των συνηθισμένων μικροσκοπίων.
3. Υπάρχουν δύο ειδικά φίλτρα, το ένα μπροστά από την πηγή φωτός χρησιμοποιείται για να φιλτράρει το ορατό φως και αυτό που βρίσκεται μεταξύ του προσοφθάλμιου φακού και του αντικειμενικού φακού χρησιμοποιείται για το φιλτράρισμα του υπεριώδους φωτός για την προστασία των ματιών.
(3) Συνεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης λέιζερ
Συνεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης λέιζερ (μικροσκόπιο ομοεστιακής σάρωσης λέιζερ, Εικόνα 2-5, 6) χρησιμοποιεί λέιζερ ως πηγή φωτός σάρωσης και σαρώνει την απεικόνιση σημείο προς σημείο, γραμμή προς γραμμή, επιφάνεια προς επιφάνεια και η συλλογή λέιζερ σάρωσης και φθορισμού μοιράζεται αντικειμενικός φακός και η εστίαση του αντικειμενικού φακού είναι Το σημείο εστίασης του λέιζερ σάρωσης είναι επίσης το αντικείμενο της στιγμιαίας απεικόνισης. Επειδή το μήκος κύματος της δέσμης λέιζερ είναι μικρό και η δέσμη είναι πολύ λεπτή, το ομοεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης λέιζερ έχει υψηλότερη ανάλυση, η οποία είναι περίπου 3 φορές μεγαλύτερη από αυτή ενός συνηθισμένου οπτικού μικροσκοπίου. Το σύστημα εστιάζει μία φορά και η σάρωση περιορίζεται σε ένα επίπεδο του δείγματος. Όταν το βάθος εστίασης είναι διαφορετικό, μπορούν να ληφθούν εικόνες διαφορετικών επιπέδων βάθους του δείγματος. Αυτές οι πληροφορίες εικόνας αποθηκεύονται στον υπολογιστή. Μέσω υπολογιστικής ανάλυσης και προσομοίωσης, μπορεί να εμφανιστεί η τρισδιάστατη δομή του δείγματος κυψέλης.
Η ομοεστιακή μικροσκοπία σάρωσης λέιζερ μπορεί να χρησιμοποιηθεί όχι μόνο για την παρατήρηση της μορφολογίας των κυττάρων, αλλά και για την ποσοτική ανάλυση των ενδοκυτταρικών βιοχημικών συστατικών, τις στατιστικές οπτικής πυκνότητας και τη μέτρηση της μορφολογίας των κυττάρων.
(4) Μικροσκόπιο σκοτεινού πεδίου
Το μικροσκόπιο σκοτεινού πεδίου (μικροσκόπιο σκοτεινού πεδίου, Εικόνα 2-7) έχει ένα φωτεινό φύλλο στο κέντρο του συμπυκνωτή, έτσι ώστε το φως φωτισμού να μην εισέρχεται απευθείας στον ανθρώπινο φακό και μόνο το φως που ανακλάται και διαθλάται από το δείγμα επιτρέπεται να εισέλθει στον αντικειμενικό φακό, επομένως το φόντο του οπτικού πεδίου είναι μαύρο, οι άκρες των αντικειμένων είναι φωτεινές. Χρησιμοποιώντας αυτό το μικροσκόπιο, μπορούν να φανούν σωματίδια τόσο μικρά όσο 4-200nm και η ανάλυση μπορεί να είναι 50 φορές μεγαλύτερη από αυτή των συνηθισμένων μικροσκοπίων.
(5) Μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης
Το μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης (μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης, Εικόνα 2-8, 9) από τον P. Zernike επινοήθηκε το 1932 και κέρδισε το Νόμπελ Φυσικής το 1953 γι' αυτό. Το μεγαλύτερο χαρακτηριστικό αυτού του μικροσκοπίου είναι ότι μπορεί να παρατηρήσει μη χρωματισμένα δείγματα και ζωντανά κύτταρα.
Η βασική αρχή της μικροσκοπίας αντίθεσης φάσης είναι η αλλαγή της διαφοράς οπτικής διαδρομής του ορατού φωτός που διέρχεται από το δείγμα σε διαφορά πλάτους, βελτιώνοντας έτσι την αντίθεση μεταξύ των διαφόρων δομών και καθιστώντας τις διάφορες δομές σαφώς ορατές. Αφού περάσει μέσα από το δείγμα, το φως διαθλάται, αποκλίνει από την αρχική οπτική διαδρομή και καθυστερεί κατά 1/4λ (μήκος κύματος). Ενισχύστε, αυξήστε ή μειώστε το πλάτος, αυξήστε την αντίθεση. Όσον αφορά τη δομή, τα μικροσκόπια αντίθεσης φάσης έχουν δύο ιδιαίτερα χαρακτηριστικά που διαφέρουν από τα συνηθισμένα οπτικά μικροσκόπια:
1. Το δακτυλιοειδές διάφραγμα βρίσκεται μεταξύ της πηγής φωτός και του συμπυκνωτή και η λειτουργία του είναι να κάνει το φως που διέρχεται από τον συμπυκνωτή να σχηματίζει έναν κοίλο φωτεινό κώνο και να εστιάζει στο δείγμα.
2. Η πλάκα φάσης (δακτυλιοειδής πλάκα φάσης) προσθέτει μια πλάκα φάσης επικαλυμμένη με φθοριούχο μαγνήσιο στον αντικειμενικό φακό, η οποία μπορεί να καθυστερήσει τη φάση του άμεσου φωτός ή του περιθλαμένου φωτός κατά 1/4λ. Υπάρχουν δύο τύποι:
① Πλάκα συν φάσης: Το άμεσο φως καθυστερεί κατά 1/4λ. Αφού συνδυαστούν οι δύο ομάδες κυμάτων φωτός, τα κύματα φωτός προστίθενται μαζί και το πλάτος αυξάνεται. Η δομή του δείγματος είναι πιο φωτεινή από το περιβάλλον μέσο, σχηματίζοντας μια φωτεινή αντίθεση (ή αρνητική αντίθεση).
② Πλάκα Β συν φάσης: Το φως που διαθλάται καθυστερεί κατά 1/4λ. Αφού συνδυαστούν τα δύο σετ ακτίνων, τα κύματα φωτός αφαιρούνται και το πλάτος γίνεται μικρότερο, σχηματίζοντας μια σκοτεινή αντίθεση (ή θετική αντίθεση) και η δομή είναι πιο σκοτεινή από το περιβάλλον μέσο.
(6) Πολωτικό μικροσκόπιο
Το πολωτικό μικροσκόπιο χρησιμοποιείται για την ανίχνευση ουσιών με διπλή διάθλαση, όπως νήματα, ατράκτους, κολλαγόνο, χρωμοσώματα και ούτω καθεξής. Η διαφορά από τα συνηθισμένα μικροσκόπια είναι ότι υπάρχει ένας πολωτής (πολωτής) μπροστά από την πηγή φωτός, έτσι ώστε το φως που εισέρχεται στο μικροσκόπιο να είναι πολωμένο φως και υπάρχει ένας αναλυτής (πολικός του οποίου η κατεύθυνση πόλωσης είναι κάθετη στον πολωτή) το βαρέλι του φακού. Το στάδιο αυτού του μικροσκοπίου μπορεί να περιστραφεί. Όταν μια μονή διαθλαστική ουσία τοποθετείται στη σκηνή, ανεξάρτητα από το πώς περιστρέφεται η σκηνή, καθώς οι δύο πολωτές είναι κάθετοι, δεν φαίνεται φως στο μικροσκόπιο και το φως δεν είναι ορατό στο μικροσκόπιο. Κατά την είσοδο σε διπλά διαθλαστικά υλικά, το στάδιο περιστροφής μπορεί να ανιχνεύσει τέτοια αντικείμενα επειδή το φως εκτρέπεται καθώς περνά μέσα από τέτοια υλικά.
