Απεικόνιση πολυφωτονικής μικροσκοπίας: διάφορες τεχνικές για την απεικόνιση νευρώνων in vivo
Σε σύγκριση με το παραδοσιακό μικροσκόπιο φθορισμού ευρέος πεδίου ενός φωτονίου, το πολυφωτονικό μικροσκόπιο (MPM) έχει τις λειτουργίες της οπτικής τομής και της βαθιάς απεικόνισης. Το 2019, ο Jerome Lecoq et al. συζήτησε τη σχετική τεχνολογία MPM από τρεις πτυχές: απεικόνιση νευρώνων βαθιά στον εγκέφαλο, μαζική απεικόνιση νευρώνων και απεικόνιση νευρώνων υψηλής ταχύτητας.
Προκειμένου να συνδεθεί η δραστηριότητα των νευρώνων με τη σύνθετη συμπεριφορά, είναι συνήθως απαραίτητο να απεικονιστούν οι νευρώνες στον εν τω βάθει φλοιό, κάτι που απαιτεί η MPM να έχει την ικανότητα εν τω βάθει απεικόνισης. Το φως διέγερσης και εκπομπής θα διασκορπιστεί σε μεγάλο βαθμό και θα απορροφηθεί από τον βιολογικό ιστό, ο οποίος είναι ο κύριος παράγοντας που περιορίζει το βάθος απεικόνισης του MPM. Αν και το πρόβλημα σκέδασης μπορεί να λυθεί αυξάνοντας την ένταση του λέιζερ, θα φέρει άλλα προβλήματα, όπως η καύση του δείγματος, η αποεστίαση και η διέγερση φθορισμού κοντά στην επιφάνεια. Ο καλύτερος τρόπος για να αυξήσετε το βάθος της απεικόνισης MPM είναι να χρησιμοποιήσετε μεγαλύτερα μήκη κύματος ως φως διέγερσης.
Επιπλέον, για την απεικόνιση δύο φωτονίων (2P), η διέγερση φθορισμού εκτός εστίασης και φθορισμού κοντά στην επιφάνεια είναι οι δύο μεγαλύτεροι περιοριστικοί παράγοντες βάθους, ενώ για την απεικόνιση τριών φωτονίων (3P), αυτά τα δύο προβλήματα μειώνονται σημαντικά, αλλά απεικόνιση τριών φωτονίων λόγω φθορισμού Η διατομή απορρόφησης της ομάδας είναι πολύ μικρότερη από αυτή του 2P, επομένως απαιτείται μια τάξη μεγέθους υψηλότερη ενέργεια παλμού για να ληφθεί το ίδιο σήμα φθορισμού έντασης με αυτό που διεγείρεται από το 2P. Το λειτουργικό μικροσκόπιο 3P είναι πιο απαιτητικό από το δομικό μικροσκόπιο 3P, το οποίο απαιτεί ταχύτερη σάρωση προκειμένου να δειγματιστεί έγκαιρα η νευρωνική δραστηριότητα. απαιτείται υψηλότερη ενέργεια παλμού για τη συλλογή επαρκών σημάτων εντός του χρόνου παραμονής κάθε pixel.
Οι σύνθετες συμπεριφορές συχνά περιλαμβάνουν μεγάλα δίκτυα εγκεφάλου με συνδέσεις τόσο τοπικές όσο και μακράς εμβέλειας. Για να συνδεθεί η δραστηριότητα των νευρώνων με τη συμπεριφορά, είναι απαραίτητο να παρακολουθείται η δραστηριότητα πολύ μεγάλων και ευρέως κατανεμημένων νευρώνων ταυτόχρονα. Το νευρωνικό δίκτυο στον εγκέφαλο επεξεργάζεται τα εισερχόμενα ερεθίσματα μέσα σε δεκάδες χιλιοστά του δευτερολέπτου. Για να κατανοήσουμε αυτό το γρήγορο νευρωνικό δίκτυο Για να μελετήσουμε τη δυναμική των νευρώνων, το MPM απαιτείται να έχει την ικανότητα να απεικονίζει γρήγορα τους νευρώνες. Οι μέθοδοι γρήγορης MPM μπορούν να χωριστούν σε τεχνικές σάρωσης μονής δέσμης και τεχνικές σάρωσης πολλαπλών δεσμών.
Η τεχνολογία σάρωσης μονής δέσμης επιτρέπει τη διέλευση του νευρικού ιστού υψηλής ταχύτητας με μεγάλο οπτικό πεδίο (FOV)
Όταν χρησιμοποιείτε MPM για την απεικόνιση νευρώνων, η σάρωση τυχαίας πρόσβασης —δηλαδή, η δέσμη λέιζερ σαρώνεται γρήγορα σε οποιοδήποτε επιλεγμένο σημείο σε ολόκληρο το οπτικό πεδίο—μπορεί να σαρώσει μόνο τους νευρώνες ενδιαφέροντος, γεγονός που όχι μόνο αποφεύγει τη σάρωση τυχόν μη επισημασμένων νευρικών ινών βελτιστοποιήστε επίσης τον χρόνο σάρωσης της δέσμης λέιζερ. Η σάρωση τυχαίας πρόσβασης (Εικ. 1) μπορεί να επιτευχθεί με έναν ακουστικό-οπτικό εκτροπέα (AOD), ο οποίος λειτουργεί συνδέοντας έναν πιεζοηλεκτρικό μετατροπέα με ένα σήμα ραδιοσυχνότητας σε έναν κατάλληλο κρύσταλλο. Τα προκύπτοντα ακουστικά κύματα προκαλούν ένα περιοδικό πλέγμα δείκτη διάθλασης. Η περίθλαση συμβαίνει όταν μια δέσμη λέιζερ διέρχεται μέσα από ένα πλέγμα. Η ένταση και η συχνότητα του ηχητικού κύματος μπορούν να ρυθμιστούν από το ηλεκτρικό σήμα ραδιοσυχνότητας για να αλλάξει η ένταση και η κατεύθυνση του περιθλαμένου φωτός, έτσι ώστε η μονοδιάστατη οριζόντια αυθαίρετη σάρωση σημείων να μπορεί να πραγματοποιηθεί χρησιμοποιώντας ένα AOD και να πραγματοποιηθεί 3D χρησιμοποιώντας ένα ζεύγος AOD σε συνδυασμό με άλλες τεχνολογίες αξονικής σάρωσης, σάρωση τυχαίας πρόσβασης. Ωστόσο, αυτή η τεχνική είναι πολύ ευαίσθητη στην κίνηση του δείγματος και επιρρεπής σε τεχνουργήματα κίνησης. Επί του παρόντος, η γρήγορη σάρωση ράστερ, δηλαδή η προοδευτική σάρωση σε FOV, χρησιμοποιείται ευρέως επειδή ο αλγόριθμος μπορεί εύκολα να λύσει τα τεχνουργήματα κίνησης.
Απεικόνιση δύο φωτονίων με βάση το AOD των νεοφλοιωδών νευρώνων L2/3 in vivo[2]
Υπάρχουν πολλοί τρόποι για να πραγματοποιήσετε γρήγορη σάρωση ράστερ, χρησιμοποιώντας έναν δονούμενο καθρέφτη για γρήγορη σάρωση 2D, συνδυάζοντας έναν δονούμενο καθρέφτη και έναν ρυθμιζόμενο ηλεκτρικό φακό για γρήγορη σάρωση 3D, αλλά ο ρυθμιζόμενος ηλεκτρικός φακός δεν μπορεί να εστιάσει γρήγορα στην αξονική κατεύθυνση λόγω του περιορισμού του Η εναλλαγή μηχανικής αδράνειας, η οποία επηρεάζει την ταχύτητα απεικόνισης, μπορεί τώρα να αντικατασταθεί με έναν διαμορφωτή χωρικού φωτός (SLM).
Η απομακρυσμένη εστίαση είναι επίσης ένα μέσο για την επίτευξη τρισδιάστατης απεικόνισης, όπως φαίνεται στο Σχήμα 2. Στη μονάδα LSU, το γαλβανόμετρο σάρωσης σαρώνει οριζόντια και η μονάδα ASU περιλαμβάνει τον αντικειμενικό φακό L1 και τον καθρέφτη M, και η αξονική σάρωση πραγματοποιείται με προσαρμογή τη θέση του M. Αυτή η τεχνική όχι μόνο μπορεί να διορθώσει την οπτική εκτροπή που εισάγεται από τον κύριο αντικειμενικό φακό L2, αλλά και να επιτρέψει τη γρήγορη αξονική σάρωση. Για να αποκτήσετε περισσότερη απεικόνιση νευρώνων, το FOV μπορεί να μεγεθυνθεί προσαρμόζοντας τη σχεδίαση του αντικειμενικού φακού του μικροσκοπίου, αλλά ο αντικειμενικός φακός με μεγάλο NA και μεγάλο FOV είναι συνήθως βαρύς και δεν μπορεί να κινηθεί γρήγορα για γρήγορη αξονική σάρωση, επομένως τα μεγάλα συστήματα FOV βασίζονται στην τηλεεστίαση , SLM και ρυθμιζόμενοι μηχανοκίνητοι φακοί.
Σχηματικό διάγραμμα ενός συστήματος απεικόνισης δύο φωτονίων απομακρυσμένης εστίασης[3] Η τεχνολογία σάρωσης πολλαπλών ακτίνων μπορεί ταυτόχρονα να απεικονίσει διαφορετικές θέσεις νευρωνικού ιστού
This technique3 typically uses two independent paths for imaging two distant (>Τοποθεσίες απεικόνισης με 1-2 mm απόσταση (Εικ. 3C,D). για γειτονικές περιοχές, συνήθως χρησιμοποιεί πολλαπλές δέσμες ενός μόνο αντικειμενικού φακού για απεικόνιση (Εικ. 3Ε, ΣΤ). Η τεχνική σάρωσης πολλαπλών ακτίνων πρέπει να δίνει ιδιαίτερη προσοχή στο πρόβλημα της αλληλεπίδρασης μεταξύ των δεσμών διέγερσης, το οποίο μπορεί να λυθεί με τη μέθοδο διαχωρισμού μεταφωτιστικής πηγής ή τη μέθοδο πολυπλεξίας χωροχρόνου. Η μέθοδος διαχωρισμού των πηγών φωτός post-hoc αναφέρεται στη χρήση αλγορίθμων για τον διαχωρισμό των ακτίνων για την εξάλειψη της αλληλεπίδρασης. Η μέθοδος πολυπλεξίας χρόνου-χώρου αναφέρεται στην ταυτόχρονη χρήση πολλαπλών δεσμών διέγερσης, οι παλμοί κάθε δέσμης καθυστερούν χρονικά, έτσι ώστε οι μεμονωμένες δέσμες που διεγείρονται από διαφορετικές δέσμες να μπορούν να διαχωριστούν προσωρινά. φθορίζον σήμα. Περισσότεροι νευρώνες μπορούν να απεικονιστούν εισάγοντας περισσότερες δέσμες, αλλά πολλαπλές δέσμες θα αυξήσουν την επικάλυψη του χρόνου διάσπασης του φθορισμού, γεγονός που περιορίζει την ικανότητα διάκρισης των πηγών σήματος. και η πολυπλεξία έχει αρνητικό αντίκτυπο στην ταχύτητα εργασίας των ηλεκτρονικών συσκευών. Υψηλές απαιτήσεις? ένας μεγάλος αριθμός ακτίνων απαιτεί επίσης υψηλότερη ισχύ λέιζερ για να διατηρηθεί μια κατά προσέγγιση αναλογία σήματος προς θόρυβο μιας μόνο δέσμης, η οποία μπορεί εύκολα να οδηγήσει σε βλάβη των ιστών.
Τεχνολογία απεικόνισης μεγάλης περιοχής
Τα τελευταία χρόνια, η ανάπτυξη διαφορετικών τεχνολογιών MPM έχει διευρύνει το εύρος της απεικόνισης του νευρικού ιστού, επιτρέποντάς μας να απεικονίζουμε περισσότερους νευρώνες βαθιά στον εγκέφαλο με μεγαλύτερη ταχύτητα, γεγονός που έχει προωθήσει σημαντικά την έρευνα της νευροεπιστήμης και μας έδωσε τη δυνατότητα να αποκτήσουμε μια σαφέστερη κατανόηση της εγκεφαλικής λειτουργίας.
