Αρχή και Εφαρμογή της Μικροσκοπίας Φθορισμού
(1) Η αρχή και τα δομικά χαρακτηριστικά του μικροσκοπίου φθορισμού: το μικροσκόπιο φθορισμού χρησιμοποιεί μια σημειακή πηγή φωτός με υψηλή φωτεινή απόδοση για να εκπέμπει φως συγκεκριμένου μήκους κύματος (όπως υπεριώδες φως 3650 in ή μοβ μπλε φως 4200 in) μέσω του συστήματος φίλτρου ως φως διέγερσης για να διεγείρει το δείγμα. Αφού η φθορίζουσα ουσία στο εσωτερικό εκπέμπει φθορισμό διαφόρων χρωμάτων, παρατηρείται μέσω της μεγέθυνσης του αντικειμενικού φακού και του προσοφθάλμιου φακού. Με αυτόν τον τρόπο, κάτω από ένα φόντο έντονης αντίθεσης, ακόμα κι αν ο φθορισμός είναι πολύ ασθενής, είναι εύκολο να αναγνωριστεί και έχει υψηλή ευαισθησία. Χρησιμοποιείται κυρίως για την έρευνα της κυτταρικής δομής και λειτουργίας και της χημικής σύνθεσης. Η βασική δομή ενός μικροσκοπίου φθορισμού αποτελείται από ένα συνηθισμένο οπτικό μικροσκόπιο συν μερικά αξεσουάρ (όπως μια πηγή φωτός φθορισμού, ένα φίλτρο διέγερσης, έναν διαχωριστή δέσμης δύο χρωμάτων και ένα φίλτρο μπλοκαρίσματος κ.λπ.). Πηγή φωτός φθορισμού - γενικά χρησιμοποιείτε λάμπα υδραργύρου υπερυψηλής πίεσης (50-200W), η οποία μπορεί να εκπέμπει φως διαφόρων μηκών κύματος, αλλά κάθε φθορίζουσα ουσία έχει ένα μήκος κύματος διέγερσης που παράγει τον ισχυρότερο φθορισμό, επομένως είναι απαραίτητο να προσθέσετε φίλτρο διέγερσης (Γενικά, υπάρχουν φίλτρα διέγερσης υπεριώδους, μωβ, μπλε και πράσινου), τα οποία επιτρέπουν μόνο στο φως διέγερσης συγκεκριμένου μήκους κύματος να περάσει και να ακτινοβολήσει το δείγμα, ενώ απορροφά άλλο φως. Αφού κάθε ουσία ακτινοβοληθεί από το φως διέγερσης, εκπέμπει ορατό φθορισμό με μεγαλύτερο μήκος κύματος από το μήκος κύματος της ακτινοβολίας σε πολύ σύντομο χρονικό διάστημα. Ο φθορισμός είναι συγκεκριμένος και γενικά ασθενέστερος από το φως διέγερσης. Για να παρατηρηθεί συγκεκριμένος φθορισμός, απαιτείται ένα φίλτρο μπλοκαρίσματος (ή καταστολής) πίσω από τον αντικειμενικό φακό. Έχει δύο λειτουργίες: η μία είναι να απορροφά και να εμποδίζει το φως διέγερσης να εισέλθει στον προσοφθάλμιο φακό, ώστε να μην διαταράσσεται ο φθορισμός και να βλάπτονται τα μάτια. το άλλο είναι να επιλέξετε και να αφήσετε τον συγκεκριμένο φθορισμό να περάσει, δείχνοντας ένα συγκεκριμένο φθορίζον χρώμα. Τα δύο φίλτρα πρέπει να χρησιμοποιούνται μαζί.
Υπάρχουν δύο τύποι μικροσκοπίων φθορισμού όσον αφορά την οπτική τους διαδρομή:
1. Μικροσκόπιο φθορισμού μετάδοσης: Η πηγή φωτός διέγερσης διεγείρει τον φθορισμό μέσω του υλικού του δείγματος μέσω του φακού του συμπυκνωτή. Ένας συλλέκτης σκοτεινού πεδίου χρησιμοποιείται συνήθως και ένας συνηθισμένος συλλέκτης μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για τη ρύθμιση του καθρέφτη έτσι ώστε το φως διέγερσης να μεταδίδεται και να παρακάμπτεται στο δείγμα. Αυτό είναι ένα παλιομοδίτικο μικροσκόπιο φθορισμού. Το πλεονέκτημα είναι ότι ο φθορισμός είναι ισχυρός σε χαμηλή μεγέθυνση και το μειονέκτημα είναι ότι ο φθορισμός μειώνεται με την αύξηση της μεγέθυνσης. Επομένως, είναι καλύτερο για την παρατήρηση μεγαλύτερων υλικών δειγμάτων.
2. Μικροσκόπιο Epi-fluorescence Αυτό είναι ένας νέος τύπος μικροσκοπίου φθορισμού που αναπτύχθηκε στη σύγχρονη εποχή. Η διαφορά είναι ότι το φως διέγερσης πέφτει από τον αντικειμενικό φακό στην επιφάνεια του δείγματος, δηλαδή, ο ίδιος αντικειμενικός φακός χρησιμοποιείται με τον συμπυκνωτή φωτισμού και τον αντικειμενικό φακό για τη συλλογή του φθορισμού. Πρέπει να προστεθεί ένας διχρωμικός διαχωριστής δέσμης στη φωτεινή διαδρομή, η οποία απέχει 45 μοίρες από το ελαφρύ ουράνιο. Το φως διέγερσης ανακλάται στον αντικειμενικό φακό και συλλέγεται στο δείγμα. Ο φθορισμός που δημιουργείται από το δείγμα και το φως διέγερσης που ανακλάται από την επιφάνεια του φακού του αντικειμενικού φακού και την επιφάνεια του γυαλιού καλύμματος εισέρχονται στον αντικειμενικό φακό ταυτόχρονα και επιστρέφουν στον διαχωριστή δέσμης δύο χρωμάτων για να διαχωρίσει το φως διέγερσης από τον φθορισμό , το υπολειπόμενο φως διέγερσης απορροφάται από τα φίλτρα μπλοκαρίσματος. Εάν αλλάξετε σε συνδυασμό διαφορετικών φίλτρων διέγερσης/διχρωματικών διαχωριστών δέσμης/φίλτρων μπλοκαρίσματος, μπορούν να καλυφθούν οι ανάγκες διαφορετικών προϊόντων αντίδρασης φθορισμού. Το πλεονέκτημα αυτού του είδους μικροσκοπίου φθορισμού είναι ότι ο φωτισμός του οπτικού πεδίου είναι ομοιόμορφος, η απεικόνιση είναι καθαρή και όσο μεγαλύτερη είναι η μεγέθυνση, τόσο ισχυρότερος είναι ο φθορισμός.
(2) Πώς να χρησιμοποιήσετε το μικροσκόπιο φθορισμού.
1. Ενεργοποιήστε την πηγή φωτός, η λυχνία υδραργύρου εξαιρετικά υψηλής πίεσης πρέπει να ζεσταθεί για λίγα λεπτά για να φτάσει στο φωτεινότερο σημείο.
2. Για το μικροσκόπιο φθορισμού μετάδοσης, το απαιτούμενο φίλτρο διέγερσης θα πρέπει να εγκατασταθεί μεταξύ της φωτεινής πηγής και του συμπυκνωτή και το αντίστοιχο φίλτρο μπλοκαρίσματος θα πρέπει να εγκατασταθεί πίσω από τον αντικειμενικό φακό. Τα μικροσκόπια επιφθορισμού πρέπει να εισάγουν τα απαιτούμενα φίλτρα διέγερσης/ενθέματα διαχωριστή διπλής δέσμης χρώματος/μπλοκαρίσματος φίλτρου στις υποδοχές στη διαδρομή φωτός.
3. Παρατηρήστε με φακό χαμηλής μεγέθυνσης και ρυθμίστε το κέντρο της πηγής φωτός σύμφωνα με τη συσκευή ρύθμισης διαφορετικών τύπων μικροσκοπίων φθορισμού, έτσι ώστε να βρίσκεται στο κέντρο ολόκληρου του σημείου φωτισμού.
4. Τοποθετήστε το φύλλο δείγματος και παρατηρήστε το αφού εστιάσετε. Πρέπει να δίνεται προσοχή κατά τη χρήση: Μην παρατηρείτε απευθείας με το φίλτρο άκρης, για να μην προκαλέσετε βλάβη στα μάτια. κατά την παρατήρηση του δείγματος με φακό λαδιού, πρέπει να χρησιμοποιείται ειδικός φακός λαδιού χωρίς φθορισμό. Αφού σβήσει η λυχνία υδραργύρου υψηλής πίεσης, δεν μπορεί να ανάψει ξανά αμέσως και πρέπει να δοκιμαστεί. Μπορεί να επανεκκινηθεί μετά από 5 λεπτά, διαφορετικά θα είναι ασταθές και θα επηρεάσει τη διάρκεια ζωής της λάμπας υδραργύρου.
(3) Παρατήρηση Χρησιμοποιώντας ένα φίλτρο μπλε-ιώδους φωτός κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού στην πλατφόρμα διδασκαλίας, μπορεί να φανεί ότι τα κύτταρα που έχουν χρωματιστεί με φθορίζουσα χρωστική πορτοκαλί ακριδίνης o,01 τοις εκατό, ο πυρήνας και το κυτταρόπλασμα διεγείρονται για να παράγουν δύο διαφορετικά χρώματα φθορισμού (σκούρο) πράσινο και πορτοκαλοκόκκινο).
