Αρχές Μικροσκοπίας Φθορισμού
Τα μικροσκόπια φθορισμού είναι διαφορετικά από τα συνηθισμένα οπτικά μικροσκόπια. Αντί να παρατηρούν δείγματα υπό τον φωτισμό συνηθισμένων πηγών φωτός, χρησιμοποιούν φως συγκεκριμένου μήκους κύματος (συνήθως υπεριώδες φως, μπλε-ιώδες φως) για να διεγείρουν τις φθορίζουσες ουσίες στα δείγματα κάτω από το μικροσκόπιο για να εκπέμπουν φθορισμό. Επομένως, η πηγή φωτός ενός μικροσκοπίου φθορισμού δεν λειτουργεί ως άμεσος φωτισμός, αλλά ως πηγή ενέργειας που διεγείρει τις φθορίζουσες ουσίες μέσα στο δείγμα. Ο λόγος για τον οποίο μπορούμε να παρατηρήσουμε το δείγμα οφείλεται στον φωτισμό της πηγής φωτός, αλλά το φαινόμενο φθορισμού που παρουσιάζεται αφού η φθορίζουσα ουσία στο δείγμα απορροφά τη διεγερμένη φωτεινή ενέργεια.
Μπορεί να φανεί ότι το χαρακτηριστικό του μικροσκοπίου φθορισμού είναι ότι η πηγή φωτός του μπορεί να παρέχει μεγάλη ποσότητα φωτός διέγερσης σε ένα συγκεκριμένο εύρος μήκους κύματος, έτσι ώστε η φθορίζουσα ουσία στο δοκιμασμένο δείγμα να μπορεί να λάβει το φως διέγερσης της απαραίτητης έντασης. Ταυτόχρονα, το μικροσκόπιο φθορισμού πρέπει να διαθέτει το αντίστοιχο σύστημα φίλτρου.
Το μικροσκόπιο φθορισμού είναι ένα απαραίτητο εργαλείο στην ιστοχημεία του ανοσοφθορισμού. Αποτελείται από πηγή φωτός εξαιρετικά υψηλής τάσης, σύστημα φίλτρου (συμπεριλαμβανομένης της πλάκας φίλτρου διέγερσης και καταστολής), οπτικό σύστημα και σύστημα φωτογραφίας και άλλα κύρια εξαρτήματα. Χρησιμοποιεί φως συγκεκριμένου μήκους κύματος για να διεγείρει το δείγμα ώστε να εκπέμπει φθορισμό.
Ο τρόπος διέγερσης του φθορισμού: Σύμφωνα με το εύρος μήκους κύματος του φωτός, μπορεί να χωριστεί σε δύο τύπους: μέθοδο διέγερσης UV (με χρήση μεθόδου υπεριώδους φωτισμού) και μέθοδο διέγερσης BV (με χρήση μπλε-ιώδους φωτός). Η μέθοδος διέγερσης UV χρησιμοποιεί σχεδόν υπεριώδες φως μικρότερο από 400 nm για διέγερση. Δεν υπάρχει ορατό φως διέγερσης σε αυτή τη μέθοδο, επομένως ο παρατηρούμενος φθορισμός παρουσιάζει τον εγγενή φθορισμό της χρωστικής και είναι εύκολο να διακριθεί ο ειδικός φθορισμός στο δείγμα από τον αυτοφθορισμό του ιστού υποβάθρου.
Η μέθοδος διέγερσης BV βασίζεται στα 404nm και στα 434nm για διέγερση από το υπεριώδες στο μπλε φως. Αυτή η μέθοδος χρησιμοποιεί μπλε φως για να ακτινοβολήσει το δείγμα, επομένως το φίλτρο αποκοπής του συστήματος παρατήρησης φθορισμού πρέπει να χρησιμοποιεί ένα φίλτρο που μπορεί να μπλοκάρει εντελώς το μπλε φως και να περάσει πλήρως τον απαιτούμενο πράσινο και κίτρινο φθορισμό. Φθορίζουσες βαφές για προσδιορισμούς φθορίζοντος αντισώματος. Το μέγιστο μήκος κύματος απορρόφησης του φωτός διέγερσης είναι σχετικά κοντά στο μέγιστο μήκος κύματος εκπομπής του φθορισμού, επομένως το φίλτρο που χρησιμοποιείται στη μέθοδο διέγερσης BV πρέπει να χρησιμοποιεί ένα αιχμηρό φίλτρο αποκοπής. Αυτή η μέθοδος μπορεί να χρησιμοποιήσει το μπλε φως ως φως διέγερσης, επομένως η αποτελεσματικότητα απορρόφησης της φθορίζουσας χρωστικής είναι υψηλότερη και μπορεί να ληφθεί πιο φωτεινή εικόνα. Το μειονέκτημά του είναι ότι ο φθορισμός κάτω από τα 500 nm δεν φαίνεται και ο φθορισμός πάνω από τα 500 nm κάνει ολόκληρη την εικόνα να φαίνεται κίτρινη. Στη μέθοδο φθορίζοντος αντισώματος, η εξειδίκευση του φθορισμού συχνά κρίνεται από το χρώμα που είναι μοναδικό για το φθόριο. Επομένως, όταν συζητείται η λεπτή εξειδίκευση, οι προαναφερθείσες ελλείψεις της μεθόδου διέγερσης BV έχουν συχνά μεγάλη επιρροή.
Συνοψίζοντας, ο φωτισμός του μικροσκοπίου φθορισμού μπορεί να εξεταστεί σύμφωνα με τα ακόλουθα τρία σημεία σύμφωνα με τη δομή του συμπυκνωτή και το μήκος κύματος του φωτός διέγερσης.
① Από την προοπτική των απαιτήσεων αντίθεσης της φθορίζουσας εικόνας, ο συμπυκνωτής σκοτεινού πεδίου διέγερσης UV χρησιμοποιείται για φωτισμό.
② Λαμβάνοντας υπόψη τη φωτεινότητα της εικόνας, το φίλτρο διέγερσης BV έχει την υψηλότερη απόδοση παρατήρησης σκοτεινού πεδίου.
③Τα χαρακτηριστικά της παρατήρησης σκοτεινού πεδίου φίλτρου διέγερσης UV και του φωτισμού συγκεντρωτή σκοτεινού πεδίου διέγερσης BV μπορούν να θεωρηθούν μεταξύ αυτών των δύο μεθόδων φωτισμού, αλλά η πρώτη έχει ισχυρότερες ιδιότητες σκοτεινού πεδίου και εμφανίζει φωτεινότερες εικόνες. Η αντίθεση είναι μικρή. Το τελευταίο διατηρεί τις ιδιότητες της φωτεινής διαδρομής του σκοτεινού πεδίου, επομένως η εμφανιζόμενη εικόνα είναι πιο σκοτεινή και η αντίθεση βελτιώνεται. Όταν χρησιμοποιείται στην πραγματικότητα ένα μικροσκόπιο φθορισμού, η μέθοδος φωτισμού που ταιριάζει καλύτερα στις απαιτήσεις του δείγματος θα πρέπει να χρησιμοποιείται για παρατήρηση.
Πρέπει να επισημανθεί ότι ακόμη και αν ο συμπυκνωτής σκοτεινού πεδίου που διεγείρεται από την υπεριώδη ακτινοβολία με την καλύτερη αντίθεση φωτίζεται, μέρος του υπεριώδους φωτός διέγερσης που διαθλάται ή διασκορπίζεται από το δείγμα θα εισέλθει στον αντικειμενικό φακό. Ο αυτοφθορισμός μπορεί να επιδεινώσει την απόκριση της εικόνας. Επομένως, ένα φίλτρο απορρόφησης UV πρέπει να χρησιμοποιείται μπροστά από τον προσοφθάλμιο ως φίλτρο αποκοπής.
