Απαιτήσεις προετοιμασίας δείγματος για μικροσκοπία φθορισμού
Απαιτήσεις για την προετοιμασία του δείγματος για μικροσκοπία φθορισμού
(1) Γυάλινη τσουλήθρα
Το πάχος του τζαμιού πρέπει να είναι μεταξύ 0.8-L2 mm. Μια διαφάνεια που είναι πολύ παχιά θα απορροφήσει περισσότερο φως από τη μία πλευρά και δεν μπορεί να εστιάσει το φως διέγερσης στο δείγμα από την άλλη. Οι πλάκες πρέπει να είναι λείες, ομοιόμορφες σε πάχος και απαλλαγμένες από εμφανή αυτοφθορισμό. Μερικές φορές χρησιμοποιούνται διαφάνειες χαλαζία.
(2) Γυαλί καλύμματος
Το πάχος του γυαλιού καλύμματος είναι περίπου 0.17 mm, λείο. Προκειμένου να ενισχυθεί το φως διέγερσης, μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί ένα γυαλί κάλυψης παρεμβολής, το οποίο είναι ένα ειδικό γυαλί επικάλυψης επικαλυμμένο με πολλά στρώματα ουσιών (όπως το φθοριούχο μαγνήσιο) που έχουν διαφορετικές επιδράσεις παρεμβολής στο φως διαφορετικών μηκών κύματος, το οποίο μπορεί να κάνει φθορισμός ομαλή. Το φως διέγερσης διέρχεται και το φως διέγερσης ανακλάται, και αυτό το ανακλώμενο φως διέγερσης μπορεί να διεγείρει το δείγμα.
(3) Δείγμα
Οι φέτες ιστού ή άλλα δείγματα δεν πρέπει να είναι πολύ παχιά. Εάν το πάχος είναι πολύ παχύ, το μεγαλύτερο μέρος του φωτός διέγερσης θα καταναλωθεί στο κάτω μέρος του δείγματος, ενώ το πάνω μέρος που παρατηρείται άμεσα από τον αντικειμενικό φακό δεν μπορεί να διεγερθεί πλήρως. Επιπλέον, ο φθορισμός που προκαλείται από επικαλυπτόμενα κύτταρα ή ακαθαρσίες, η μη ειδική χρώση φόντου επηρεάζει την κρίση.
(4) λάδι καθρέφτη
Γενικά, κατά την παρατήρηση δειγμάτων με μικροσκόπια φθορισμού σκοτεινού πεδίου και μικροσκόπια εμβάπτισης λαδιού, πρέπει να χρησιμοποιείται λάδι εμβάπτισης. Είναι καλύτερο να χρησιμοποιείτε ειδικό μη φθορίζον λάδι εμβάπτισης. Αντ' αυτού μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί γλυκερίνη και υγρή παραφίνη, αλλά ο δείκτης διάθλασης είναι χαμηλός, γεγονός που επηρεάζει ελαφρά την ποιότητα της εικόνας.
Κατανόηση του κύβου φωτός της μικροσκοπίας φθορισμού
Ο φθορισμός είναι το φως που τα ηλεκτρόνια μιας ουσίας απορροφούν φωτεινή ενέργεια από μια κατάσταση χαμηλής ενέργειας σε μια κατάσταση υψηλής ενέργειας και στη συνέχεια απελευθερώνουν φως όταν επιστρέψει σε κατάσταση χαμηλής ενέργειας. Είναι φως που δεν εκπέμπεται από τη θερμοκρασία—φωταύγεια. Δηλαδή: η ουσία απορροφά φως βραχέων κυμάτων, εισέρχεται σε διεγερμένη κατάσταση και εκπέμπει φως μεγάλου κύματος.
Είτε είναι ο αυτοφθορισμός της ουσίας, η φθορίζουσα βαφή ή η φθορίζουσα πρωτεΐνη που εκφράζεται με σύντηξη, πρέπει να διεγείρεται από ένα συγκεκριμένο μήκος κύματος φωτός (Διέγερση). Αφού τα ηλεκτρόνια μεταναστεύσουν και χάσουν ενέργεια, εκπέμπουν φως συγκεκριμένου μεγάλου μήκους κύματος (Emision). , τα οποία μπορούν να συλλεχθούν από το σύστημα ανίχνευσης για να επιτευχθεί η λειτουργία αναγνώρισης συγκεκριμένου φθορισμού.
Τι είναι ένας κύβος φωτός φθορισμού;
Στην παρατήρηση και απεικόνιση με μικροσκόπιο φθορισμού, το φως διέγερσης συγκεκριμένου μήκους κύματος και το αντίστοιχο φως εκπομπής μεγάλου μήκους κύματος παρέχονται από τον κύβο φωτός φθορισμού, έτσι ώστε το σήμα φθορισμού να μπορεί να συλλέγεται με γυμνό μάτι, οθόνη οθόνης ή κάμερα. Επομένως, ο κύβος φωτός φθορισμού καθορίζει τι μπορεί να ανιχνευθεί. Η βασική συσκευή του σήματος φθορισμού, τα χαρακτηριστικά της περιλαμβάνουν EX: παραμέτρους φίλτρου μήκους κύματος διέγερσης, EM: παραμέτρους φίλτρου μήκους κύματος εκπομπής και DM: παραμέτρους διχοτομικού καθρέφτη. Πάρτε για παράδειγμα τον κύβο φωτός DAPI του ενσωματωμένου μικροσκοπίου φθορισμού Revolve, EX: 385/30, EM: 450/50, DM: 425.
The light emitted by the light source passes through DAPI EX to obtain excitation light in a specific wavelength range, that is, light of 385±15nm, which specifically excites fluorescent substances that can only be excited within this range; the DM dichroic mirror separates the excitation light from the fluorescence Optical elements, as special mirrors, reflect only specific wavelengths of light and allow all other wavelengths to pass through, so only >Το φως 425nm μπορεί να μεταδοθεί στο EM. Τα φίλτρα εκπομπής EM χρησιμοποιούνται για τον διαχωρισμό του φθορισμού που εκπέμπεται από το φθοροφόρο από άλλα οπτικά στοιχεία φόντου για το διαχωρισμό του φωτός. Τα φίλτρα εκπομπής μεταδίδουν φως στο μήκος κύματος φθορισμού μέσω του διχρωματικού καθρέφτη ενώ εμποδίζουν όλο το άλλο φως που διαρρέει από την πηγή φωτός διέγερσης (που αντανακλάται από το δείγμα ή την οπτική). Το εκπεμπόμενο μήκος κύματος φωτός είναι μεγαλύτερο από το ΕΜ που πρέπει να παρατηρηθεί, δηλαδή μόνο φως εντός της περιοχής 450±25 nm εισέρχεται στο σύστημα ανίχνευσης. Η σωστή επιλογή φίλτρων EX, EM και διχοτομιών DM μπορεί να βοηθήσει τους ερευνητές να επιτύχουν υψηλότερους λόγους σήματος προς θόρυβο (S/N).
