Τεχνικά χαρακτηριστικά και δεξιότητες χρήσης μικροσκοπίου φθορισμού δύο φωτονίων
Το μικροσκόπιο φθορισμού δύο φωτονίων είναι μια νέα τεχνολογία που συνδυάζει ομοεστιακή μικροσκοπία σάρωσης με λέιζερ και τεχνολογία διέγερσης δύο φωτονίων.
Η βασική αρχή της διέγερσης με δύο φωτόνια είναι: στην περίπτωση υψηλής πυκνότητας φωτονίων, τα φθορίζοντα μόρια μπορούν να απορροφήσουν δύο φωτόνια μεγάλου μήκους κύματος ταυτόχρονα και να εκπέμπουν ένα φωτόνιο μικρότερου μήκους κύματος μετά από μια σύντομη περίοδο ζωής της λεγόμενης διεγερμένης κατάστασης . ; Το αποτέλεσμα είναι το ίδιο με τη χρήση ενός φωτονίου με μήκος κύματος το μισό του μεγάλου μήκους κύματος για να διεγείρει ένα φθορίζον μόριο. Η διέγερση με δύο φωτόνια απαιτεί υψηλή πυκνότητα φωτονίων. Για να μην βλάψει τα κύτταρα, το μικροσκόπιο δύο φωτονίων χρησιμοποιεί παλμικά λέιζερ με κλειδωμένη λειτουργία υψηλής ενέργειας. Το λέιζερ που εκπέμπεται από αυτό το λέιζερ έχει υψηλή ενέργεια αιχμής και χαμηλή μέση ενέργεια, το πλάτος του παλμού του είναι μόνο 100 femtoseconds και η περίοδός του μπορεί να φτάσει τα 80 έως 100 megahertz. Όταν χρησιμοποιείται αντικειμενικός φακός υψηλού αριθμητικού διαφράγματος για την εστίαση των φωτονίων του παλμικού λέιζερ, η πυκνότητα φωτονίων στο εστιακό σημείο του αντικειμενικού φακού είναι η υψηλότερη και η διέγερση δύο φωτονίων εμφανίζεται μόνο στο εστιακό σημείο του αντικειμενικού φακού. το μικροσκόπιο δύο φωτονίων δεν χρειάζεται ομοεστιακή οπή καρφίτσας, η οποία βελτιώνει την απόδοση ανίχνευσης φθορισμού. Είναι μια σημαντική ερευνητική μέθοδος στους τομείς της μορφολογίας, της μοριακής κυτταρικής βιολογίας, της νευροεπιστήμης και της φαρμακολογίας.
1. Το υπόβαθρο της εμφάνισης της μικροσκοπίας δύο φωτονίων - δύο περιορισμοί της παραδοσιακής ομοεστιακής μικροσκοπίας λέιζερ:
1) Το ένα είναι το φαινόμενο της φωτοτοξικότητας: επειδή η ομοεστιακή οπή πρέπει να είναι αρκετά μικρή για να ληφθεί μια εικόνα υψηλής ανάλυσης και το μικρό άνοιγμα θα μπλοκάρει μεγάλο μέρος του φθορισμού που εκπέμπεται από το δείγμα, συμπεριλαμβανομένου του φθορισμού που εκπέμπεται από το εστιακό επίπεδο, το αντίστοιχο Ναι, το φως διέγερσης πρέπει να είναι αρκετά ισχυρό ώστε να επιτυγχάνεται επαρκής λόγος σήματος προς θόρυβο. και το λέιζερ υψηλής έντασης θα προκαλέσει τη γρήγορη εξασθένιση της φθορίζουσας βαφής κατά τη συνεχή σάρωση και το φθορίζον σήμα θα γίνεται όλο και πιο αδύναμο καθώς προχωρά η σάρωση.
2) Η φωτοτοξικότητα είναι ένα άλλο πρόβλημα. Κάτω από ακτινοβολία λέιζερ, πολλά μόρια φθορίζουσας βαφής θα παράγουν κυτταροτοξίνες όπως μονό οξυγόνο ή ελεύθερες ρίζες, επομένως ο χρόνος σάρωσης και η πυκνότητα οπτικής ισχύος του φωτός διέγερσης θα πρέπει να περιοριστούν στο πείραμα για να διατηρηθεί η πυκνότητα του δείγματος. ενεργός. Στην έρευνα για ενεργά δείγματα, ειδικά τα διάφορα στάδια ανάπτυξης και ανάπτυξης των ενεργών δειγμάτων, η φωτολεύκανση και η φωτοτοξικότητα καθιστούν αυτές τις μελέτες πολύ περιορισμένες.
2. Γιατί λέτε ότι τα μικροσκόπια δύο φωτονίων γενικά δεν χρειάζεται να είναι εξοπλισμένα με λέιζερ υπεριώδους διέγερσης;
Το μικροσκόπιο δύο φωτονίων είναι μια τεχνολογία διέγερσης φθορισμού που βασίζεται στο φαινόμενο διέγερσης δύο φωτονίων: τα μόρια φθορίζουσας χρωστικής μπορούν να διεγερθούν απορροφώντας δύο φωτόνια χαμηλής ενέργειας ταυτόχρονα (το χρονικό διάστημα μεταξύ δύο φωτονίων που φθάνουν σε φθορίζοντα μόρια είναι μικρότερο από 1 femtosecond ), το αποτέλεσμα διέγερσής του μπορεί να είναι ισοδύναμο με την απορρόφηση ενός φωτονίου υψηλής ενέργειας μήκους κύματος 1/2. Για παράδειγμα, η απορρόφηση δύο φωτονίων σε κόκκινα μήκη κύματος ισοδυναμεί με ένα μόριο που απορροφά το υπεριώδες. Τα φωτόνια μεγάλου μήκους κύματος δεν απορροφώνται εύκολα από τα κύτταρα, επομένως η φωτοτοξικότητα στα ζωντανά κύτταρα μειώνεται και η φωτολεύκανση μειώνεται επίσης. Με αυτόν τον τρόπο, όχι μόνο παίζει τη λειτουργία της υπεριώδους διέγερσης, αλλά επίσης αποφεύγει τη βλάβη του υπεριώδους φωτός στο δείγμα.
3. Τι το ιδιαίτερο έχει το λέιζερ του μικροσκοπίου δύο φωτονίων;
Η πιθανότητα απορρόφησης δύο φωτονίων εξαρτάται από το πόσο στενά συμπίπτουν τα δύο προσπίπτοντα φωτόνια στο χώρο και στο χρόνο (τα δύο φωτόνια πρέπει να φτάσουν εντός 10-18 δευτερολέπτων). Η διατομή απορρόφησης δύο φωτονίων είναι μικρή και μόνο τα φθοροφόρα σε περιοχές με μεγάλη ροή φωτονίων διεγείρονται. Επομένως, τα περισσότερα από τα λέιζερ που χρησιμοποιούνται είναι λέιζερ ζαφείρι τιτανίου, τα οποία μπορούν να επιτύχουν ταχύτητες σάρωσης picosecond ή femtosecond και έχουν πολύ υψηλή ισχύ αιχμής και χαμηλή μέση ισχύ, έτσι ώστε η φωτολεύκανση και η φωτοτοξικότητα να μπορούν να μειωθούν ή να εξαλειφθούν. Το πιο σημαντικό είναι να παρέχεται μια πολύ υψηλή πυκνότητα φωτονίων σε μια μικρή περιοχή, η οποία μπορεί να εξασφαλίσει την ταυτόχρονη διέγερση δύο φωτονίων.
4. Ποια είναι τα πλεονεκτήματα της διέγερσης με δύο φωτόνια;
1) Αυξήστε την επιλεκτικότητα της βαφής: το εύρος φωτός διέγερσης του συνεστιακού συστήματος λέιζερ (Ar, Ar/Kr, HeNe) είναι 488nm - 647nm. Αυτό σημαίνει πειραματισμό με φθορίζουσες βαφές διεγερμένες από την υπεριώδη ακτινοβολία, π.χ. με DAPI, Hoescht. Το μήκος κύματος διέγερσης των δύο φωτονίων είναι διπλάσιο από το μονοφωτόνιο, επομένως οι βαφές που διεγείρονται από το υπεριώδες μπορούν να διεγερθούν από το εγγύς υπέρυθρο φως.
2) Μειώστε τη φωτολεύκανση: Λόγω της μείωσης της φωτολεύκανσης, το ποσοστό επιτυχίας των πειραμάτων που χρησιμοποιούν CFP/YFP για μεταφορά ενέργειας συντονισμού φθορισμού (FRET) αυξάνεται.
3) Δεν απαιτείται ειδικός αντικειμενικός φακός: Από την άποψη του υλικού, η διέγερση των χρωστικών που διεγείρονται από την υπεριώδη ακτινοβολία με το μήκος κύματος του εγγύς υπέρυθρου φωτός δεν απαιτεί ειδικά οπτικά εξαρτήματα UV.
4) Βελτιώστε την αναλογία σήματος προς θόρυβο: το μήκος κύματος του φωτός διέγερσης και το μήκος κύματος του εκπεμπόμενου φωτός έχουν μεγάλη διαφορά, γεγονός που βελτιώνει την αναλογία σήματος προς θόρυβο.
5) Λεύκανση εντοπισμένη στο εστιακό σημείο: Εφόσον η διέγερση φθορισμού συμβαίνει μόνο στο εστιακό σημείο του αντικειμενικού φακού, δεν υπάρχει ανάγκη για ομοεστιακή οπή. Αυτό βελτιώνει την ανίχνευση φωτός και η φωτολεύκανση εμφανίζεται μόνο στο εστιακό σημείο.
6) Εύκολη διείσδυση σε δείγματα: Το υπέρυθρο φως μήκους κύματος δεν διασκορπίζεται εύκολα από τα κελιά και μπορεί να διεισδύσει σε βαθύτερα δείγματα.
5. Σε σύγκριση με την ομοεστιακή μικροσκοπία σάρωσης λέιζερ, ποια είναι η μεγαλύτερη βελτίωση που έχει κάνει η μικροσκοπία δύο φωτονίων;
1) Μειωμένη φωτολεύκανση.
2) Μειωμένη φωτοτοξικότητα.
3) Δεν είναι εύκολο να διασκορπιστεί, και είναι πιο εύκολο να διεισδύσει σε παχιά δείγματα, όπως φέτες εγκεφάλου.
