Η διαφορά μεταξύ (δύο φωτονίων, ομοεστιακού) μικροσκοπίου φθορισμού και συνηθισμένου μικροσκοπίου
Η βασική αρχή της διέγερσης των δύο φωτονίων είναι ότι σε υψηλή πυκνότητα φωτονίων, τα φθορίζοντα μόρια μπορούν να απορροφήσουν ταυτόχρονα δύο φωτόνια μήκους μήκους κύματος και να εκπέμπουν ένα μικρότερο φωτόνιο μήκους κύματος μετά από μια σύντομη περίοδο της λεγόμενης διεγερμένης κατάστασης ζωής. Το αποτέλεσμα είναι το ίδιο με τη χρήση ενός φωτονίου με το ήμισυ του μήκους κύματος του μακρού μήκους κύματος για να διεγείρει τα φθορίζοντα μόρια. Δύο διέγερση φωτονίων απαιτούν υψηλή πυκνότητα φωτονίων και προκειμένου να αποφευχθεί η καταστροφή των κυττάρων, η μικροσκοπία δύο φωτονίων χρησιμοποιεί λέιζερ παλμών υψηλής ενέργειας. Το λέιζερ που εκπέμπεται από αυτό το λέιζερ έχει υψηλή μέγιστη ενέργεια και χαμηλή μέση ενέργεια, με πλάτος παλμού μόνο 100 femtoseconds και συχνότητα μέχρι 80 έως 100 megahertz. Όταν χρησιμοποιείτε έναν αντικειμενικό φακό υψηλού αριθμητικού ανοίγματος για να εστιάσετε τα φωτόνια ενός παλμικού λέιζερ, η πυκνότητα φωτονίων στο εστιακό σημείο του αντικειμενικού φακού είναι ο υψηλότερος και η διέγερση δύο φωτονίων εμφανίζεται μόνο στο επίκεντρο του αντικειμενικού φακού. Επομένως, το μικροσκόπιο δύο φωτονίων δεν απαιτεί μια ομοεστιακή οπή, η οποία βελτιώνει την αποτελεσματικότητα της ανίχνευσης φθορισμού.
Γενικά φαινόμενα φθορισμού, λόγω της χαμηλής πυκνότητας φωτονίων του φωτός διέγερσης, ένα μόριο φθορισμού μπορεί να απορροφήσει μόνο ένα φωτόνιο κάθε φορά και στη συνέχεια να εκπέμπει ένα άλλο φθορίζον φωτονίο μέσω της μεταβατικής ακτινοβολίας, η οποία είναι γνωστή ως μονής φωτονικής φθορισμού. Για τις διεργασίες διέγερσης φθορισμού που χρησιμοποιούν λέιζερ ως πηγές φωτός, μπορεί να εμφανιστούν φαινόμενα φθορισμού δύο φωτονίων ή ακόμη και πολλαπλών φαινομένων. Σε αυτή την περίπτωση, η πηγή φωτός διέγερσης έχει υψηλή ένταση και πυκνότητα φωτονίων που ανταποκρίνεται στην απαίτηση για φθορίζοντα μόρια να απορροφούν ταυτόχρονα δύο φωτόνια. Στη διαδικασία χρήσης ενός γενικού λέιζερ ως πηγής φωτός διέγερσης, η πυκνότητα των φωτονίων εξακολουθεί να είναι ανεπαρκής για την παραγωγή φαινομένου απορρόφησης δύο φωτονίων. Συνήθως, χρησιμοποιούνται λέιζερ παλμών femtosecond, με στιγμιαία ισχύ να φτάνουν στο επίπεδο megawatt. Επομένως, το μήκος κύματος του φθορισμού δύο φωτονίων είναι μικρότερο από αυτό του φωτός διέγερσης, ισοδύναμο με το αποτέλεσμα που παράγεται με διέγερση μήκους κύματος διέγερσης.
Γνώση που σχετίζεται με τη μικροσκοπία ομοεστιακής φθορισμού
Η βασική αρχή της μικροσκοπίας ομοεστιακής φθορισμού είναι να χρησιμοποιηθεί μια πηγή φωτός σημείου για να ακτινοβολήσει το δείγμα, σχηματίζοντας ένα καλά καθορισμένο μικρό σημείο φωτός στο εστιακό επίπεδο. Ο φθορισμός που εκπέμπεται από αυτό το σημείο μετά την ακτινοβόληση συλλέγεται από τον αντικειμενικό φακό και αποστέλλεται πίσω κατά μήκος της αρχικής διαδρομής ακτινοβολίας προς τον διαχωριστή δέσμης που αποτελείται από ένα διχροϊκό καθρέφτη. Το φασματόμετρο στέλνει φθορισμό απευθείας στον ανιχνευτή. Υπάρχει μια οπή μπροστά τόσο στην πηγή φωτός όσο και στον ανιχνευτή, που ονομάζεται Pinhole Illumination και η ανίχνευση, αντίστοιχα. Οι γεωμετρικές διαστάσεις των δύο είναι συνεπείς, περίπου 100-200 nm; Σε σύγκριση με το φως του εστιακού επιπέδου, τα δύο είναι συζευγμένα, πράγμα που σημαίνει ότι το φως του φωτός περνάει μέσα από μια σειρά φακών και μπορεί τελικά να επικεντρωθεί τόσο στην πύλη φωτισμού όσο και στην ανίχνευση ταυτόχρονα. Με αυτόν τον τρόπο, το φως από το εστιακό επίπεδο μπορεί να συγκλίνει εντός της περιοχής της οπής ανίχνευσης, ενώ το διάσπαρτο φως από πάνω ή κάτω από το εστιακό επίπεδο εμποδίζεται έξω από την οπή ανίχνευσης και δεν μπορεί να απεικονιστεί. Η σάρωση του σημείου δείγματος ανά σημείο με ένα λέιζερ, ο σωλήνας φωτοπολλαπλασιασμού μετά την ανίχνευση της πύργου αποκτά επίσης την αντίστοιχη ομοεστιακή εικόνα του σημείου φωτός ανά σημείο, το μετατρέπει σε ένα ψηφιακό σήμα και το μεταδίδει στον υπολογιστή και τελικά το συγκεντρώνει σε μια σαφή ομοεστιακή εικόνα ολόκληρου του εστιακού επιπέδου στην οθόνη.
