Η μικροσκοπία φθορισμού δύο φωτονίων έχει πολλά πλεονεκτήματα:
1) Τα μεγαλύτερα μήκη κύματος φωτός επηρεάζονται λιγότερο από τη σκέδαση από τα μικρότερα μήκη κύματος φωτός για να διεισδύσουν στο δείγμα.
(2) Τα μόρια φθορισμού εκτός του εστιακού επιπέδου δεν διεγείρονται έτσι ώστε περισσότερο φως διέγερσης να μπορεί να φτάσει στο εστιακό επίπεδο, έτσι ώστε το φως διέγερσης να μπορεί να διεισδύσει βαθύτερα στο δείγμα.
3) Τα μεγαλύτερα μήκη κύματος κοντά στο υπέρυθρο φως είναι λιγότερο τοξικά για τα κύτταρα από τα μικρότερα μήκη κύματος.
4) Όταν χρησιμοποιείται μικροσκόπιο δύο φωτονίων για την παρατήρηση ενός δείγματος, η φωτολεύκανση και η φωτοτοξικότητα υπάρχουν μόνο στο εστιακό επίπεδο. Ως εκ τούτου, τα μικροσκόπια δύο φωτονίων είναι πιο κατάλληλα από τα μικροσκόπια ενός φωτονίου για την παρατήρηση παχύρρευστων δειγμάτων, για την παρατήρηση ζωντανών κυττάρων ή για τη διεξαγωγή πειραμάτων φωτολεύκανσης κηλίδων.
Γνώση μικροσκοπίου ομοεστιακού φθορισμού
Η βασική αρχή του ομοεστιακού μικροσκοπίου φθορισμού: χρησιμοποιείται μια σημειακή πηγή φωτός για την ακτινοβολία του δείγματος, σχηματίζοντας ένα μικρό, καλά καθορισμένο σημείο φωτός στο εστιακό επίπεδο. Ο φθορισμός που εκπέμπεται από αυτό το σημείο μετά την ακτινοβολία συλλέγεται από τον αντικειμενικό φακό και αποστέλλεται πίσω στον διαχωριστή δέσμης που αποτελείται από ένα αμφίδρομο χρωματικό κάτοπτρο κατά μήκος της αρχικής διαδρομής φωτός ακτινοβολίας. Ο διαχωριστής δέσμης στέλνει τον φθορισμό απευθείας στον ανιχνευτή. Τόσο η πηγή φωτός όσο και ο ανιχνευτής έχουν το καθένα μια οπή καρφίτσας μπροστά τους, που ονομάζεται pinhole φωτισμού και pinhole ανίχνευσης, αντίστοιχα. Και τα δύο έχουν την ίδια γεωμετρία, περίπου 100-200 nm, και είναι συζευγμένα ως προς το σημείο φωτός στο εστιακό επίπεδο, δηλαδή, το σημείο φωτός διέρχεται από μια σειρά φακών και μπορεί τελικά να εστιαστεί και στα δύο φωτιστικά και οπές ανίχνευσης. Με αυτόν τον τρόπο, το φως από το εστιακό επίπεδο μπορεί να συγκλίνει εντός του ανοίγματος του ανιχνευτή, ενώ το σκεδαζόμενο φως από πάνω ή κάτω από το εστιακό επίπεδο μπλοκάρεται έξω από το άνοιγμα του ανιχνευτή και δεν μπορεί να απεικονιστεί. Το λέιζερ σαρώνει το δείγμα σημείο προς σημείο και ο σωλήνας φωτοπολλαπλασιαστή μετά την ανίχνευση της οπής λαμβάνει επίσης την ομοεστιακή εικόνα του αντίστοιχου φωτός σημείο προς σημείο, το οποίο μετατρέπεται σε ψηφιακό σήμα και μεταδίδεται στον υπολογιστή και τελικά συγκλίνει σε καθαρό ομοεστιακή εικόνα ολόκληρου του εστιακού επιπέδου στην οθόνη.
Κάθε εικόνα εστιακού επιπέδου είναι στην πραγματικότητα μια οπτική διατομή του δείγματος και αυτή η οπτική διατομή έχει πάντα ένα ορισμένο πάχος, γνωστό και ως οπτικό φύλλο. Δεδομένου ότι η ένταση φωτός στο εστιακό σημείο είναι πολύ μεγαλύτερη από αυτή στο μη εστιακό σημείο και το μη εστιακό επίπεδο φως φιλτράρεται από την οπή καρφίτσας, το βάθος πεδίου του ομοεστιακού συστήματος προσεγγίζεται στο μηδέν, και η σάρωση κατά μήκος της κατεύθυνσης του άξονα Z επιτρέπει στην οπτική τομογραφία να σχηματίσει μια δισδιάστατη οπτική τομή του δείγματος που θα παρατηρηθεί στο εστιακό σημείο. Συνδυάζοντας τη σάρωση επιπέδου XY (εστιακό επίπεδο) με τη σάρωση με άξονα Z (οπτικός άξονας), μια τρισδιάστατη εικόνα του δείγματος μπορεί να ληφθεί με τη συσσώρευση διαδοχικών στρωμάτων δισδιάστατων εικόνων, οι οποίες επεξεργάζονται από εξειδικευμένο λογισμικό υπολογιστή.
Αυτό σημαίνει ότι η οπή ανίχνευσης και η οπή της πηγής φωτός εστιάζονται πάντα στο ίδιο σημείο, έτσι ώστε ο φθορισμός που διεγείρεται έξω από το εστιακό επίπεδο να μην μπορεί να εισέλθει στην οπή ανίχνευσης.
Η αρχή λειτουργίας του συνεστιακού λέιζερ εκφράζεται απλώς ότι χρησιμοποιεί λέιζερ ως πηγή φωτός, με βάση την παραδοσιακή απεικόνιση μικροσκοπίου φθορισμού, πρόσθετη συσκευή σάρωσης λέιζερ και συσκευή συζευγμένης εστίασης, μέσω ελέγχου υπολογιστή για την εκτέλεση συστήματος λήψης και επεξεργασίας ψηφιακής εικόνας.
