Διαφορές και χαρακτηριστικά μεταξύ μικροσκοπίων φθορισμού και συνηθισμένων οπτικών μικροσκοπίων
Το μικροσκόπιο φθορισμού διαφέρει από το συνηθισμένο οπτικό μικροσκόπιο στο ότι δεν παρατηρεί δείγματα υπό τον φωτισμό συνηθισμένων πηγών φωτός. Αντίθετα, χρησιμοποιεί ένα ορισμένο μήκος κύματος φωτός (συνήθως υπεριώδες φως, μπλε ιώδες φως) για να διεγείρει τις φθορίζουσες ουσίες μέσα στο δείγμα κάτω από το μικροσκόπιο, προκαλώντας τους να εκπέμπουν φθορισμό. Ως εκ τούτου, ο ρόλος της πηγής φωτός στο μικροσκόπιο φθορισμού δεν είναι ο άμεσος φωτισμός, αλλά ως πηγή ενέργειας για τη διέγερση των φθοριζουσών ουσιών μέσα στο δείγμα. Ο λόγος για τον οποίο μπορούμε να παρατηρήσουμε δείγματα δεν οφείλεται στον φωτισμό της πηγής φωτός, αλλά στο φαινόμενο φθορισμού που παρουσιάζουν οι φθορίζουσες ουσίες μέσα στο δείγμα μετά την απορρόφηση της διεγερμένης φωτεινής ενέργειας. Από αυτό, φαίνεται ότι το χαρακτηριστικό της μικροσκοπίας φθορισμού είναι κυρίως ότι η πηγή φωτός της μπορεί να παρέχει μεγάλη ποσότητα φωτός διέγερσης σε ένα συγκεκριμένο εύρος μήκους κύματος, έτσι ώστε οι φθορίζουσες ουσίες στο δείγμα να μπορούν να αποκτήσουν την απαραίτητη ένταση φωτός διέγερσης. Ταυτόχρονα, τα μικροσκόπια φθορισμού πρέπει να διαθέτουν αντίστοιχα συστήματα φίλτρων. Το μικροσκόπιο φθορισμού είναι ένα θεμελιώδες εργαλείο στη χημεία των ιστών φθορισμού. Αποτελείται από κύρια εξαρτήματα όπως μια πηγή φωτός υπερ-υψηλής τάσης, ένα σύστημα φίλτρου (συμπεριλαμβανομένων των πλακών φίλτρων διέγερσης και καταστολής), ένα οπτικό σύστημα και ένα σύστημα φωτογραφίας. Χρησιμοποιεί φως συγκεκριμένου μήκους κύματος για να διεγείρει το δείγμα και να εκπέμπει φθορισμό.
1. Μέθοδοι διέγερσης φθορισμού: Σύμφωνα με το εύρος μήκους κύματος του φωτός, υπάρχουν δύο τύποι: μέθοδος διέγερσης UV (με χρήση υπεριώδους φωτισμού) και μέθοδος διέγερσης BV (με χρήση μπλε ιώδους φωτός). Η μέθοδος διέγερσης με υπεριώδη ακτινοβολία χρησιμοποιεί σχεδόν υπεριώδες φως μικρότερο από 400 nm για διέγερση. Αυτή η μέθοδος δεν έχει ορατό φως διέγερσης, επομένως ο παρατηρούμενος φθορισμός εμφανίζει τον εγγενή φθορισμό της χρωστικής, καθιστώντας εύκολη τη διάκριση του συγκεκριμένου φθορισμού στο δείγμα από τον αυτοφθορισμό του ιστού υποβάθρου.
2. Μέθοδος διέγερσης BV: Περιλαμβάνει διέγερση από το υπεριώδες σε μπλε φως με κέντρο στα 404nm και 434nm. Αυτή η μέθοδος χρησιμοποιεί μπλε φως για να ακτινοβολήσει το δείγμα, επομένως το φίλτρο αποκοπής-του συστήματος παρατήρησης φθορισμού πρέπει να χρησιμοποιεί ένα φίλτρο που μπορεί να μπλοκάρει πλήρως το μπλε φως και να περάσει πλήρως από τον απαιτούμενο πράσινο και κίτρινο φθορισμό. Φθορίζουσες χρωστικές που χρησιμοποιούνται για τη μέθοδο αντισωμάτων φθορισμού. Το μέγιστο μήκος κύματος απορρόφησης του φωτός διέγερσης και το μέγιστο μήκος κύματος εκπομπής του φθορισμού είναι σχετικά κοντά, επομένως το φίλτρο που χρησιμοποιείται στη μέθοδο διέγερσης BV πρέπει να χρησιμοποιεί ένα φίλτρο απότομης κοπής. Αυτή η μέθοδος μπορεί να χρησιμοποιήσει το μπλε φως ως φως διέγερσης, επομένως η αποτελεσματικότητα απορρόφησης των φθοριζόντων χρωστικών είναι υψηλή και μπορούν να ληφθούν φωτεινότερες εικόνες. Το μειονέκτημα είναι ότι ο φθορισμός κάτω των 500 nm δεν μπορεί να φανεί, ενώ ο φθορισμός πάνω από τα 500 nm κάνει ολόκληρη την εικόνα να φαίνεται κίτρινη. Στη μέθοδο φθορίζοντος αντισώματος, η εξειδίκευση καθορίζεται ως επί το πλείστον από το μοναδικό χρώμα για τις φθορίζουσες χρωστικές, επομένως όταν συζητείται η λεπτή εξειδίκευση, τα μειονεκτήματα της μεθόδου διέγερσης BV που αναφέρθηκαν παραπάνω έχουν συχνά σημαντικό αντίκτυπο.
