Ενίσχυση των πλεονεκτημάτων της πολυφωτονικής μικροσκοπίας σάρωσης με λέιζερ
Η πολυφωτονική μικροσκοπία σάρωσης με λέιζερ είναι μια σημαντική βελτίωση σε σχέση με την οπτική μικροσκοπία. Μπορεί να παρατηρήσει τη βαθιά δομή ζωντανών κυττάρων, σταθερών κυττάρων και ιστών και μπορεί να αποκτήσει σαφείς και αιχμηρές πολυστρωματικές δομές Z-επίπεδου, δηλαδή οπτικές τομές, από τις οποίες μπορεί να κατασκευάσει την τρισδιάστατη συμπαγή δομή του δείγματος. Η ομοεστιακή μικροσκοπία χρησιμοποιεί μια πηγή φωτός λέιζερ που, μετά την επέκταση, γεμίζει ολόκληρο το πίσω εστιακό επίπεδο του αντικειμενικού φακού και στη συνέχεια περνά μέσα από το σύστημα φακών του αντικειμενικού φακού για να συγκλίνει σε ένα πολύ μικρό σημείο στο εστιακό επίπεδο του δείγματος. Ανάλογα με το αριθμητικό διάφραγμα του αντικειμενικού φακού, η διάμετρος του φωτεινότερου σημείου φωτισμού είναι περίπου 0.25 ~ 0.8μm και το βάθος είναι περίπου 0.5 ~ 1,5μm . Το μέγεθος του ομοεστιακού σημείου εξαρτάται από τον σχεδιασμό του μικροσκοπίου, το μήκος κύματος του λέιζερ, τα χαρακτηριστικά του αντικειμενικού φακού, τις ρυθμίσεις κατάστασης της μονάδας σάρωσης και τις ιδιότητες του δείγματος. Το μικροσκόπιο πεδίου έχει μεγάλο εύρος και βάθος φωτισμού, ενώ το ομοεστιακό μικροσκόπιο έχει έναν εστιασμένο φωτισμό εστιασμένο σε ένα εστιακό σημείο στο εστιακό επίπεδο. Το πιο βασικό πλεονέκτημα της ομοεστιακής μικροσκοπίας είναι ότι μπορεί να εκτελέσει λεπτή οπτική τομή παχύρρευστων φθοριζόντων δειγμάτων (που μπορεί να φτάσει τα 50 μm ή περισσότερο) και το πάχος των τομών είναι περίπου 0,5 έως 1,5 μm. Μια σειρά εικόνων οπτικής τομής μπορεί να ληφθεί μετακινώντας το δείγμα πάνω και κάτω χρησιμοποιώντας τον βηματικό κινητήρα του άξονα Z του μικροσκοπίου. Η λήψη πληροφοριών εικόνας ελέγχεται εντός του επιπέδου και δεν θα παρεμποδίζεται από σήματα που εκπέμπονται από άλλες θέσεις στο δείγμα. Μετά την αφαίρεση της επιρροής του φθορισμού φόντου και την αύξηση της αναλογίας σήματος προς θόρυβο, η αντίθεση και η ανάλυση των ομοεστιακών εικόνων βελτιώνονται σημαντικά σε σύγκριση με τις παραδοσιακές εικόνες φθορισμού με φωτισμό πεδίου. Σε πολλά δείγματα, πολλά περίπλοκα δομικά στοιχεία συμπλέκονται για να σχηματίσουν πολύπλοκα συστήματα, αλλά μόλις συλλεχθούν αρκετά οπτικά τμήματα, μπορούμε να τα ανακατασκευάσουμε σε τρεις διαστάσεις μέσω λογισμικού. Αυτή η πειραματική μέθοδος έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως στη βιολογική έρευνα για την αποσαφήνιση των πολύπλοκων δομικών και λειτουργικών σχέσεων μεταξύ κυττάρων ή ιστών.
