Τεχνικές χρώσης και μικροσκοπική παρατήρηση μικροοργανισμών
1. Σκοπός
1.1 Μάθετε τις βασικές τεχνικές μικροβιακών επιχρισμάτων και χρώσης.
1.2 Κατακτήστε την απλή μέθοδο χρώσης βακτηρίων.
1.3 Κατανοήστε προκαταρκτικά τα μορφολογικά χαρακτηριστικά των βακτηρίων και παγιώστε τη γνώση του τρόπου χρήσης των φακών λαδιού και των τεχνικών ασηπτικής λειτουργίας.
2 Αρχές
Η επίχριση και η χρώση βακτηρίων είναι μια βασική τεχνική στα μικροβιολογικά πειράματα. Τα βακτηριακά κύτταρα είναι μικρά και διαφανή, γεγονός που καθιστά δύσκολο τον εντοπισμό τους κάτω από ένα συνηθισμένο μικροσκόπιο φωτός. πρέπει να λερωθούν. Χρησιμοποιείται μία μόνο χρωστική ουσία για τη βαφή των βακτηρίων, έτσι ώστε τα λεκιασμένα βακτήρια να σχηματίζουν μια σαφή χρωματική διαφορά από το φόντο, ώστε η μορφολογία και η δομή τους να παρατηρούνται πιο καθαρά. Αυτή η μέθοδος είναι εύκολη στη λειτουργία και κατάλληλη για την παρατήρηση του γενικού σχήματος των βακτηριακών κυττάρων και της διάταξης των βακτηρίων. Οι βασικές βαφές χρησιμοποιούνται συνήθως για απλή χρώση. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι σε ουδέτερα, αλκαλικά ή ασθενώς όξινα διαλύματα, τα βακτηριακά κύτταρα είναι συνήθως αρνητικά φορτισμένα και όταν οι βασικές βαφές ιονίζονται, το τμήμα βαφής των μορίων τους είναι θετικά φορτισμένο, άρα είναι αλκαλικά. Το τμήμα χρώσης της βαφής συνδυάζεται εύκολα με βακτήρια για να τα χρωματίσει. Τα βαμμένα βακτηριακά κύτταρα έρχονται σε έντονη αντίθεση με το φόντο, καθιστώντας ευκολότερη την αναγνώρισή τους στο μικροσκόπιο. Οι βαφές που χρησιμοποιούνται συνήθως για απλή βαφή περιλαμβάνουν το μπλε του μεθυλενίου, το κρυσταλλικό ιώδες, τη βασική φουξίνη κ.λπ. Όταν τα βακτήρια αποσυνθέτουν τα σάκχαρα και παράγουν οξύ, προκαλώντας πτώση του pH του μέσου καλλιέργειας, το θετικό φορτίο στα βακτήρια αυξάνεται. Αυτή τη στιγμή, όξινες βαφές όπως η ηωσίνη, η όξινη φουξίνη ή το κόκκινο του Κονγκό μπορούν να χρησιμοποιηθούν για χρώση. Τα βακτήρια πρέπει να στερεώνονται πριν από τη χρώση. Έχει δύο σκοπούς: ο ένας είναι να σκοτώσει τα βακτήρια και να τα κάνει να προσκολληθούν στη γυάλινη πλάκα. το άλλο είναι να αυξηθεί η συγγένειά τους για τις βαφές. Δύο κοινά χρησιμοποιούμενες μέθοδοι είναι η θέρμανση και η χημική στερέωση. Κατά τη στερέωση, προσπαθήστε να διατηρήσετε το αρχικό σχήμα των κυψελών.
3 υλικά
3.1 Βακτήρια: Bacillus subtilis 12-18h λοξή καλλιέργεια θρεπτικού άγαρ, Staphylococcus aureus 24ωρη καλλιέργεια θρεπτικού άγαρ, Escherichia coli 24ωρη καλλιέργεια θρεπτικού άγαρ, καλλιέργεια άγαρ αρτοποιίας μαγιάς λοξής.
3.2 Βαφή: Αλκαλική βαφή μπλε μεθυλενίου Lu's (ή βαφή οξαλικού αμμωνίου κρυσταλλική βιολέτα), βαφή φουξίνης καρβολικού οξέος.
3.3 Όργανα ή άλλα σκεύη: μικροσκόπιο, λυχνία αλκοόλης, διαφάνεια, βρόχος ενοφθαλμισμού, σχάρα, μπουκάλι διπλής στρώσης (που περιέχει λάδι κέδρου και ξυλόλιο), ιστός φακών, φυσιολογικός ορός ή απεσταγμένο νερό κ.λπ.
4. Διαδικασία: επίχρισμα → στέγνωμα → σταθεροποίηση → χρώση → πλύσιμο → στέγνωμα → μικροσκοπική εξέταση.
5 βήματα
5.1 Επάλειψη: Πάρτε δύο καθαρές και χωρίς λάδια γυάλινες πλάκες. Υπό αποστειρωμένες συνθήκες, ρίξτε μια μικρή σταγόνα φυσιολογικού ορού (ή απεσταγμένου νερού) σε κάθε κέντρο της γυάλινης πλάκας. Χρησιμοποιήστε ένα βρόχο εμβολιασμού για να αποστειρώσετε τα βακτήρια από το Bacillus subtilis. , Micrococcus luteus και Escherichia coli, μαζέψτε λίγο βακτηριακό γκαζόν στα σταγονίδια νερού στην κλίση, ανακατέψτε καλά και απλώστε το σε μια λεπτή μεμβράνη. Εάν χρησιμοποιείτε επίχρισμα βακτηριακού εναιωρήματος (ή υγρής καλλιέργειας), μπορείτε να χρησιμοποιήσετε έναν βρόγχο εμβολιασμού για να επιλέξετε 2 έως 3 βρόχους και να τους εφαρμόσετε απευθείας στην αντικειμενοφόρο πλάκα. Προσέξτε να μην ρίξετε πολύ φυσιολογικό ορό (απεσταγμένο νερό) και να αφαιρέσετε τα βακτήρια και να το εφαρμόσετε ομοιόμορφα και όχι πολύ πυκνά.
5.2 Στέγνωμα Στεγνώστε φυσικά σε θερμοκρασία δωματίου. Μπορείτε επίσης να το ζεστάνετε ελαφρώς πάνω από μια λάμπα αλκοόλης με την επικαλυμμένη πλευρά προς τα πάνω για να στεγνώσει. Φροντίστε όμως να μην πλησιάσετε πολύ τη φλόγα, καθώς η πολύ υψηλή θερμοκρασία θα καταστρέψει τη μορφολογία των βακτηρίων.
5.3 Στερέωση Εάν χρησιμοποιείται θερμαινόμενη ξήρανση, η στερέωση και η ξήρανση συνδυάζονται σε ένα βήμα και η μέθοδος είναι ίδια με την ξήρανση. Αλείψτε, στεγνώστε και διορθώστε τη θερμότητα.
5.4 Χρώση: Τοποθετήστε την αντικειμενοφόρο πλάκα επίπεδη στη σχάρα αντικειμενοφόρου πλάκας και προσθέστε 1 έως 2 σταγόνες διαλύματος βαφής στο επίχρισμα (είναι σκόπιμο το διάλυμα βαφής να καλύπτει απλώς τη μεμβράνη επιχρίσματος). Χρωματίστε με βασικό μπλε του μεθυλενίου Lu για 1 έως 2 λεπτά και χρωματίστε με καρβολικό οξύ φουξίνη (ή οξαλικό αμμώνιο κρυσταλλικό ιώδες) για περίπου 1 λεπτό.
5.5 Πλύσιμο με νερό: Αδειάστε το διάλυμα βαφής και ξεπλύνετε απαλά με νερό βρύσης από το ένα άκρο της αντικειμενοφόρου πλάκας μέχρι το νερό που τρέχει από το επίχρισμα να είναι άχρωμο. Όταν πλένετε με νερό, μην πλένετε την επικαλυμμένη επιφάνεια απευθείας με νερό. Η ροή του νερού δεν πρέπει να είναι πολύ γρήγορη ή πολύ μεγάλη για να αποτρέψει την πτώση της μεμβράνης.
5.6 Στέγνωμα: Ανακινήστε τα σταγονίδια νερού από τη διαφάνεια και στεγνώστε φυσικά, στεγνώστε με πιστολάκι μαλλιών ή απορροφήστε το με απορροφητικό χαρτί (προσέξτε να μην σκουπίσετε τα βακτήρια). 5.7 Μικροσκοπική εξέταση Αφού στεγνώσει το επίχρισμα, κάντε μικροσκοπική εξέταση. Το επίχρισμα πρέπει να είναι εντελώς στεγνό πριν το δείτε με φακό λαδιού.
6 Αποτελέσματα Σχεδιάστε τη μορφολογία των E. coli και Micrococcus luteus που παρατηρήθηκαν μετά από απλή χρώση.
