Προσδιορισμός του αριθμού των μικροοργανισμών - η άμεση μέθοδος μέτρησης του μικροσκοπίου!
Η ανάπτυξη του βακτηριακού πληθυσμού εκδηλώνεται με αύξηση του αριθμού των κυττάρων ή αύξηση της κυτταρικής μάζας. Οι μέθοδοι για τον προσδιορισμό του αριθμού των κυττάρων περιλαμβάνουν τη μέθοδο μέτρησης με απευθείας μικροσκόπιο, τη μέθοδο μέτρησης αποικιών πλακών, τη μέθοδο αναλογίας φωτοηλεκτρικού λαδιού, τη μέθοδο μέγιστης πιθανότητας και τη μέθοδο διήθησης με μεμβράνη. Οι μέθοδοι μέτρησης της κυτταρικής ύλης περιλαμβάνουν τον προσδιορισμό του ξηρού βάρους των κυττάρων, τον προσδιορισμό ορισμένων κυτταρικών συστατικών όπως η περιεκτικότητα σε άζωτο, RNA και DNA και τον προσδιορισμό των μεταβολιτών. Εν ολίγοις, υπάρχουν πολλές μέθοδοι για τη μέτρηση της ανάπτυξης μικροοργανισμών, η καθεμία με τα δικά της πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα, και θα πρέπει να επιλέγονται ανάλογα με τη συγκεκριμένη κατάσταση. Αυτό το πείραμα εισάγει κυρίως τη μέθοδο άμεσης μέτρησης μικροσκοπίου που χρησιμοποιείται συνήθως στην παραγωγή και την επιστημονική έρευνα.
1. Απαιτήσεις Σκοπού
1. Αποσαφηνίστε την αρχή του αριθμού των αιμοσφαιρίων.
2. Κατακτήστε τη μέθοδο μέτρησης μικροοργανισμών χρησιμοποιώντας μετρητή αιμοσφαιρίων.
2. Βασικές αρχές
Η μέθοδος άμεσης μέτρησης με μικροσκόπιο είναι μια απλή, γρήγορη και διαισθητική μέθοδος για την απευθείας μέτρηση μιας μικρής ποσότητας αιωρήματος του δείγματος που πρόκειται να δοκιμαστεί σε μια ειδική γυάλινη αντικειμενοφόρο πλάκα με μια συγκεκριμένη περιοχή και όγκο (επίσης γνωστή ως μετρητής βακτηρίων). Μέθοδοι. Επί του παρόντος, οι μετρητές βακτηρίων που χρησιμοποιούνται συνήθως στο εσωτερικό και στο εξωτερικό είναι: πίνακας μέτρησης κυττάρων αίματος, μετρητής βακτηρίων Peteroff-Hauser και μετρητής βακτηρίων Hawksley, κ.λπ. η βασική αρχή είναι η ίδια. Οι δύο τελευταίοι τύποι μετρητών βακτηρίων έχουν συνολικό όγκο 0.02 mm3 αφού καλυφθούν με γυαλί κάλυψης και η απόσταση μεταξύ του γυαλιού καλύμματος και της πλάκας είναι μόνο 0,02 mm, επομένως το λάδι Ο αντικειμενικός φακός εμβάπτισης μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την παρατήρηση και την παρατήρηση μικρών κυττάρων όπως τα βακτήρια. μετρώ. Εκτός από αυτά τα βακτηριόμετρα, υπάρχει επίσης μια μέθοδος εκτίμησης για την αναλογία της περιοχής του επιχρίσματος προς την περιοχή του οπτικού πεδίου που παρατηρείται απευθείας στο μικροσκόπιο, η οποία χρησιμοποιείται γενικά για τη βακτηριολογική εξέταση του γάλακτος. Τα πλεονεκτήματα της μεθόδου άμεσης μέτρησης μικροσκοπίου είναι διαισθητικά, γρήγορα και εύκολα στη χρήση. Ωστόσο, το μειονέκτημα αυτής της μεθόδου είναι ότι το μετρούμενο αποτέλεσμα είναι συνήθως το άθροισμα νεκρών και ζωντανών κυττάρων. Επί του παρόντος, υπάρχουν ορισμένες μέθοδοι για να ξεπεραστεί αυτό το μειονέκτημα, όπως ο συνδυασμός καλλιέργειας μικροθαλάμου που χρωματίζουν βιώσιμα βακτήρια (μικρό χρονικό διάστημα) και η προσθήκη αναστολέων κυτταρικής διαίρεσης για να επιτευχθεί ο σκοπός της μέτρησης μόνο βιώσιμων βακτηρίων.
Σε αυτό το πείραμα, ένα αιμοκυτταρόμετρο χρησιμοποιήθηκε ως παράδειγμα για άμεση μικροσκοπική μέτρηση. Για τη χρήση των άλλων δύο τύπων μετρητών βακτηρίων, ανατρέξτε στις οδηγίες κάθε κατασκευαστή. Η μέτρηση απευθείας στο μικροσκόπιο με αιμοκυτταρόμετρο είναι μια ευρέως χρησιμοποιούμενη μέθοδος για την καταμέτρηση μικροοργανισμών. Η πλάκα μέτρησης είναι μια ειδική γυάλινη τσουλήθρα, στην οποία σχηματίζονται τρεις πλατφόρμες από τέσσερις υποδοχές. η ευρύτερη πλατφόρμα στη μέση χωρίζεται σε δύο μισά με μια κοντή εγκάρσια σχισμή και υπάρχει ένα πλέγμα σε κάθε πλευρά της πλατφόρμας. Κάθε πλέγμα χωρίζεται σε εννέα μεγάλα τετράγωνα και το μεγάλο τετράγωνο στη μέση είναι η αίθουσα μέτρησης. Η δομή της πλάκας μέτρησης των αιμοσφαιρίων φαίνεται στο Σχήμα l{{{{10}}}}. Η κλίμακα της αίθουσας μέτρησης έχει γενικά δύο προδιαγραφές, η μία είναι ένα μεγάλο τετράγωνο χωρισμένο σε 25 μεσαία τετράγωνα και κάθε μεσαίο τετράγωνο χωρίζεται σε 16 μικρά τετράγωνα (Εικόνα 15-2). το άλλο είναι μια μεγάλη πλατεία. Το τετράγωνο χωρίζεται σε 16 μεσαία τετράγωνα και κάθε μεσαίο τετράγωνο χωρίζεται σε 25 μικρά τετράγωνα, αλλά ανεξάρτητα από το είδος του πίνακα μέτρησης, υπάρχουν 400 μικρά τετράγωνα σε κάθε μεγάλο τετράγωνο. Το μήκος της πλευράς κάθε μεγάλου τετραγώνου είναι 1mm και η περιοχή κάθε μεγάλου τετραγώνου είναι 1mm2. Μετά την κάλυψη με γυαλί κάλυψης, το ύψος μεταξύ του γυαλιού κάλυψης και του γυαλιού ολίσθησης είναι 0,1 mm, επομένως ο όγκος του θαλάμου μέτρησης είναι 0,lmm3 (ένα χιλιοστό του χιλιοστόλιτρου). Εικόνα 15-1 Η δομή του πίνακα μέτρησης αιμοσφαιρίων (1) Εικόνα 15-2 Η δομή του πίνακα μέτρησης αιμοσφαιρίων (2) A. Μπροστινή όψη. Β. Όψη διαμήκους τομής. Το μεγεθυσμένο πλέγμα, το μεγάλο τετράγωνο στη μέση είναι ο θάλαμος μέτρησης 1. Πλάκα μέτρησης αιμοσφαιρίων. 2. Γυαλί καλύμματος. 3. Όταν μετράτε στο θάλαμο μέτρησης, συνήθως μετράτε τον συνολικό αριθμό των βακτηρίων σε πέντε τετράγωνα, στη συνέχεια υπολογίστε τον μέσο όρο κάθε τετραγώνου και πολλαπλασιάστε με το 25 ή το 16 για να πάρετε Ο συνολικός αριθμός βακτηρίων σε ένα μεγάλο τετράγωνο μετατρέπεται σε συνολικός αριθμός βακτηρίων σε 1 ml βακτηριακού διαλύματος. Έστω Α ο συνολικός αριθμός βακτηρίων στα πέντε τετράγωνα και ο λόγος αραίωσης του βακτηριακού διαλύματος Β. Εάν πρόκειται για πλάκα μέτρησης με 25 τετράγωνα, ο συνολικός αριθμός βακτηρίων σε 1 mL βακτηριακού διαλύματος {{26} } A/5×25×104× B=50000A·B(κομμάτια) Ομοίως, εάν πρόκειται για πλάκα μέτρησης με 16 μεσαία τετράγωνα, ο συνολικός αριθμός βακτηρίων σε 1 mL βακτηριακού διαλύματος=A/ 5×16×104×B=32000A·B (κομμάτια)
3. Εξοπλισμός
1. Βακτήρια
Σακχαρομύκητες cerevisiae
2. Όργανα ή άλλα σκεύη
Αιμοκυτταρόμετρο, μικροσκόπιο, καλυπτρίδα, αποστειρωμένο τριχοειδές σταγονόμετρο.
4. Βήματα λειτουργίας
1. Παρασκευή βακτηριακού εναιωρήματος
Το Saccharomyces cerevisiae παρασκευάστηκε σε ένα βακτηριακό εναιώρημα κατάλληλης συγκέντρωσης με στείρο φυσιολογικό ορό.
2. Αίθουσα μέτρησης μικροσκοπίου
Πριν προσθέσετε δείγματα, επιθεωρήστε μικροσκοπικά τον θάλαμο μέτρησης της πλάκας μέτρησης. Εάν υπάρχει βρωμιά, πρέπει να καθαριστεί και να στεγνώσει πριν την καταμέτρηση.
3. Προσθέστε δείγμα
Καλύψτε το καθαρό και στεγνό αιμοκυτταρόμετρο με καλυπτρίδα και, στη συνέχεια, χρησιμοποιήστε ένα αποστειρωμένο τριχοειδές σταγονόμετρο για να ρίξετε μια μικρή σταγόνα του ανακινημένου εναιωρήματος Saccharomyces cerevisiae από την άκρη της καλυπτρίδας και αφήστε το βακτηριακό διάλυμα να κινηθεί αυτόματα κατά μήκος του διακένου μέσω τριχοειδούς όσμωσης. Μπαίνοντας στην αίθουσα μέτρησης, η γενική αίθουσα καταμέτρησης μπορεί να γεμίσει με βακτηριακό υγρό. Κατά τη δειγματοληψία, ανακινήστε πρώτα το βακτηριακό διάλυμα. κατά την προσθήκη δειγμάτων, δεν πρέπει να δημιουργούνται φυσαλίδες αέρα στο θάλαμο μέτρησης.
4. Καταμέτρηση μικροσκοπίου
Αφού προσθέσετε το δείγμα, μείνετε ακίνητοι για 5 λεπτά, στη συνέχεια τοποθετήστε το αιμοκυτταρόμετρο στη σκηνή του μικροσκοπίου, βρείτε πρώτα τη θέση του θαλάμου μέτρησης με ένα μικροσκόπιο χαμηλής ισχύος και, στη συνέχεια, μεταβείτε σε μικροσκόπιο υψηλής ισχύος για μέτρηση. Ρυθμίστε κατάλληλα την ένταση του φωτός του μικροσκοπίου. Για μικροσκόπια που χρησιμοποιούν καθρέφτες για φωτισμό, προσέξτε να μην αποκλίνουν από τη μία πλευρά του φωτός, διαφορετικά δεν θα είναι εύκολο να δείτε τις τετράγωνες γραμμές της αίθουσας μέτρησης καθαρά στο οπτικό πεδίο ή μόνο κάθετες ή οριζόντιες γραμμές θα να φανεί. Εάν διαπιστωθεί ότι το βακτηριακό διάλυμα είναι πολύ συμπυκνωμένο ή πολύ αραιωμένο πριν από την καταμέτρηση, είναι απαραίτητο να αναπροσαρμόσετε την αραίωση πριν από την καταμέτρηση. Γενικά, η αραίωση του δείγματος απαιτεί περίπου 5 έως 10 βακτήρια σε κάθε μικρό κύτταρο. Κάθε θάλαμος μέτρησης επιλέγει 5 μεσαία κελιά (προαιρετικά 4 γωνίες και ένα μεσαίο κελί στο κέντρο) για μέτρηση. Τα κελιά που βρίσκονται στη γραμμή πλέγματος υπολογίζονται γενικά μόνο στην επάνω και στη δεξιά γραμμή. Στην περίπτωση εκβλάστησης ζυμομύκητα, όταν το μέγεθος του μπουμπουκιού φτάσει στο μισό του μητρικού κυττάρου, υπολογίζεται ως δύο βακτηριακά κύτταρα. Για να μετρήσετε ένα δείγμα, υπολογίστε την περιεκτικότητα σε βακτήρια του δείγματος υπολογίζοντας τη μέση τιμή από τους δύο θαλάμους μέτρησης.
5. Πλύνετε τον αριθμό των αιμοσφαιρίων
Μετά τη χρήση, ξεπλύνετε τον πίνακα μέτρησης αιμοσφαιρίων με νερό στη βρύση, μην τρίβετε με σκληρά αντικείμενα και στεγνώστε τον μόνοι σας ή με πιστολάκι μαλλιών μετά το πλύσιμο. Μικροσκοπική εξέταση για να παρατηρηθεί εάν υπάρχουν υπολειμματικά βακτήρια ή άλλα ιζήματα σε κάθε μικρό κύτταρο. Εάν δεν είναι καθαρό, πρέπει να πλυθεί επανειλημμένα μέχρι να είναι καθαρό.
