Πλεονεκτήματα βελτίωσης της μικροσκοπίας πολυφωτονικής σάρωσης με λέιζερ
Η πολυφωτονική μικροσκοπία σάρωσης με λέιζερ αντιπροσωπεύει μια σημαντική πρόοδο στην οπτική μικροσκοπία. Επιτρέπει την παρατήρηση βαθιών δομών σε ζωντανά κύτταρα, σταθερά κύτταρα και ιστούς, ενώ συλλαμβάνει καθαρές και αιχμηρές δομές πολλαπλών επιπέδων Z-δηλαδή οπτικές τομές-που μπορούν να χρησιμοποιηθούν περαιτέρω για την ανακατασκευή της τρισδιάστατης στερεάς δομής των δειγμάτων.
Ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο υιοθετεί μια πηγή φωτός λέιζερ. Η δέσμη λέιζερ επεκτείνεται για να φωτίσει πλήρως το πίσω εστιακό επίπεδο του αντικειμενικού φακού, μετά περνά μέσα από το σύστημα αντικειμενικών φακών και συγκλίνει σε ένα εξαιρετικά μικροσκοπικό σημείο στο εστιακό επίπεδο του δείγματος. Ανάλογα με το αριθμητικό άνοιγμα του αντικειμενικού φακού, η διάμετρος του φωτισμένου σημείου κυμαίνεται περίπου από 0,25 έως 0,8 μm, με αξονικό βάθος περίπου 0,5 έως 1,5 μm. Το μέγεθος του ομοεστιακού σημείου καθορίζεται από το σχεδιασμό του μικροσκοπίου, το μήκος κύματος του λέιζερ, τα αντικειμενικά χαρακτηριστικά, τις ρυθμίσεις της μονάδας σάρωσης και τις ιδιότητες του δείγματος.
Τα μικροσκόπια ευρέος πεδίου διαθέτουν μεγάλο εύρος φωτισμού και βαθύ βάθος φωτισμού, ενώ το ομοεστιακό μικροσκόπιο συγκεντρώνει τον φωτισμό σε ένα ακριβές εστιακό σημείο στο εστιακό επίπεδο. Το βασικό πλεονέκτημα της ομοεστιακής μικροσκοπίας έγκειται στην ικανότητά της να εκτελεί λεπτή οπτική τομή σε παχιά φθορίζοντα δείγματα (έως 50 μm ή περισσότερο), με πάχος κάθε τμήματος να κυμαίνεται από 0,5 έως 1,5 μm.
Μια σειρά εικόνων οπτικής τομής αποκτάται μετακινώντας το δείγμα κατακόρυφα μέσω του βηματικού κινητήρα ακριβείας του άξονα Z του μικροσκοπίου. Η συλλογή σημάτων εικόνας περιορίζεται αυστηρά στο στοχευμένο εστιακό επίπεδο και είναι απαλλαγμένη από παρεμβολές από σήματα που προέρχονται από άλλες θέσεις εντός του δείγματος. Μετά την εξάλειψη του φθορισμού φόντου και τη βελτίωση της αναλογίας σήματος προς θόρυβο, οι ομοεστιακές εικόνες παρουσιάζουν σημαντικά υψηλότερη αντίθεση και ανάλυση σε σύγκριση με τις παραδοσιακές εικόνες φθορισμού ευρέος πεδίου.
Στα περισσότερα δείγματα, περίπλοκα δομικά στοιχεία συνυφαίνονται για να σχηματίσουν πολύπλοκα συστήματα. Μόλις συλλεχθεί επαρκής αριθμός οπτικών τμημάτων, η τρισδιάστατη ανακατασκευή μπορεί να ολοκληρωθεί χρησιμοποιώντας επαγγελματικό λογισμικό. Αυτή η πειραματική μέθοδος έχει εφαρμοστεί ευρέως στη βιολογική έρευνα για την αποσαφήνιση των πολύπλοκων δομικών και λειτουργικών σχέσεων μεταξύ κυττάρων και ιστών.
