Ο όγκος του δείγματος ιστού μπλοκάρει
Σε μικροσκόπια εξοπλισμένα με φακό συμπυκνωτή, μπορείτε να μετακινήσετε τον συμπυκνωτή πάνω και κάτω για να ρυθμίσετε τη φωτεινότητα στο κατάλληλο επίπεδο. Επιπλέον, μπορείτε να αλλάξετε το διάφραγμα του διαφράγματος ίριδας για να αποκτήσετε την κατάλληλη φωτεινότητα. Εάν το φως είναι πολύ αμυδρό, σηκώστε κατάλληλα τον συμπυκνωτή και ανοίξτε το άνοιγμα του διαφράγματος ίριδας ευρύτερα. Εάν το φως είναι πολύ δυνατό, χαμηλώστε τον συμπυκνωτή κατάλληλα και μειώστε το άνοιγμα του διαφράγματος της ίριδας. Εάν το φως εξακολουθεί να είναι αστραφτερό μετά από αυτές τις ρυθμίσεις, τοποθετήστε ένα κατάλληλο φίλτρο στη βάση κάτω από τον συμπυκνωτή για να επιτύχετε ικανοποιητικό φωτισμό. Φυσικά, η ικανότητα προσαρμογής της κατακόρυφης θέσης του συμπυκνωτή, η ρύθμιση του ανοίγματος του διαφράγματος ίριδας και η επιλογή κατάλληλων φίλτρων απαιτεί συσσωρευμένη πρακτική εμπειρία με την πάροδο του χρόνου.
Μια άλλη κρίσιμη πτυχή της βιολογικής μικροσκοπίας έγκειται στις διαδικασίες δειγματοληψίας υλικού και απομόνωσης κυττάρων. Μετά την λυοφιλίωση (FD), την ενσωμάτωση ρητίνης και την κατεψυγμένη υπερλεπτή τομή, πρέπει να λαμβάνεται μεγάλη προσοχή για τη διατήρηση της στοιχειακής σύνθεσης όλων των κυτταρικών συστατικών χωρίς να καταστρέφονται τα κύτταρα που προορίζονται για παρατήρηση και ανάλυση. Η μικροανάλυση με ακτίνες Χ περιλαμβάνει πολύπλοκες διαδικασίες και υψηλό κόστος. Θα ήταν λυπηρό να εξάγουμε λανθασμένα συμπεράσματα εάν τα κύτταρα που εξετάστηκαν μετά από μακρά και πολλαπλά στάδια προετοιμασία είναι κατεστραμμένα ή μη βιώσιμα. Για παράδειγμα, τα καρδιομυοκύτταρα που απομονώνονται μέσω πέψης κολλαγενάσης παρουσιάζουν δύο μορφολογικές μορφές: επιμήκη κύτταρα σε σχήμα ράβδου και στρογγυλά κύτταρα. Τα στρογγυλά είναι κατεστραμμένα κύτταρα που πεθαίνουν που τραυματίζονται κατά την απομόνωση των κυττάρων.
Η περιεκτικότητα και η κατανομή των ηλεκτρολυτών διαφέρει σημαντικά μεταξύ αυτών των δύο τύπων κυττάρων. Τα στρογγυλά καρδιομυοκύτταρα περιέχουν εξαιρετικά υψηλά επίπεδα νατρίου και πολύ χαμηλά επίπεδα καλίου, μαζί με αξιοσημείωτα αυξημένη συγκέντρωση ασβεστίου στα μιτοχόνδρια. Η διασταυρούμενη επαλήθευση με άλλες αναλυτικές μεθόδους επιβεβαιώνει ότι το υψηλό νάτριο, χαμηλό κάλιο και υψηλό μιτοχονδριακό ασβέστιο στα στρογγυλά κύτταρα προκύπτουν από βλάβη στην κυτταρική μεμβράνη κατά την απομόνωση.
Η κρυοκαθήλωση των κυττάρων και των ιστών συνήθως ξεκινά με κατάψυξη κατά βύθιση, ακολουθούμενη από αποθήκευση σε υγρό άζωτο. Η κατάψυξη κατά βύθιση είναι ζωτικής σημασίας για την ποιότητα διατήρησης. Τα ζωντανά κύτταρα και οι φρέσκοι ιστοί περιέχουν άφθονο νερό. Κατά τη διάρκεια της κατάψυξης, τα μέρη των κυττάρων ή των ιστών που έρχονται σε άμεση επαφή με το κρυογόνο (ιδιαίτερα το υγρό άζωτο) παγώνουν και στερεώνονται πρώτα, σχηματίζοντας ένα παγωμένο κέλυφος που εμποδίζει την ταχεία κατάψυξη και στερέωση της κεντρικής περιοχής του δείγματος. Κατά συνέπεια, κρύσταλλοι πάγου παρατηρούνται συχνά στην κεντρική περιοχή μεγαλύτερων κυττάρων κατά τη διάρκεια της μικροανάλυσης με ακτίνες Χ.
Για να αποφευχθεί αυτό το πρόβλημα, υιοθετούνται κρυογόνα με σημείο τήξης υψηλότερο από το υγρό άζωτο αλλά χαμηλότερο από -80 βαθμούς. Μεταξύ των διαφόρων διαθέσιμων επιλογών, το υγρό προπάνιο είναι εύκολο να ληφθεί, χαμηλού κόστους και προσφέρει εξαιρετικά γρήγορο ρυθμό ψύξης (σημείο βρασμού: −42,12 βαθμοί, σημείο τήξης: −187,1 βαθμοί, μοριακό βάρος: 44,1). Το μόνο του μειονέκτημα είναι η ευφλεκτότητα.
