Διαφορές μεταξύ μικροσκοπίων φθορισμού και συνηθισμένων μικροσκοπίων φωτός
Τα μικροσκόπια φθορισμού διαφέρουν από τα συμβατικά οπτικά μικροσκόπια. Αντί να παρατηρούν δείγματα με φως από μια συνηθισμένη πηγή φωτός, χρησιμοποιούν φως συγκεκριμένου μήκους κύματος (συνήθως υπεριώδες ή μπλε-ιώδες φως) για να διεγείρουν φθορίζουσες ουσίες εντός του δείγματος στη διαφάνεια του μικροσκοπίου, προκαλώντας αυτές τις ουσίες να εκπέμπουν φθορισμό. Επομένως, η πηγή φωτός ενός μικροσκοπίου φθορισμού δεν φωτίζει άμεσα το δείγμα. δρα ως πηγή ενέργειας για να διεγείρει τις ενδογενείς φθορίζουσες ουσίες στο δείγμα. Μπορούμε να δούμε το δείγμα όχι λόγω του φωτισμού από την ίδια την πηγή φωτός, αλλά επειδή οι φθορίζουσες ουσίες μέσα στο δείγμα απορροφούν τη φωτεινή ενέργεια διέγερσης και στη συνέχεια εκπέμπουν φθορισμό.
Επομένως, το βασικό χαρακτηριστικό ενός μικροσκοπίου φθορισμού είναι ότι η πηγή φωτός του μπορεί να παρέχει φως διέγερσης συγκεκριμένης ζώνης μήκους κύματος, επιτρέποντας στις φθορίζουσες ουσίες στο επιθεωρούμενο δείγμα να εκπέμπουν φθορισμό επαρκούς έντασης. Εν τω μεταξύ, ένα μικροσκόπιο φθορισμού πρέπει να είναι εξοπλισμένο με αντίστοιχο σύστημα φίλτρου. Είναι ένα απαραίτητο όργανο για την ιστοχημεία φθορισμού. Ένα μικροσκόπιο φθορισμού αποτελείται κυρίως από μια πηγή φωτός εξαιρετικά υψηλής πίεσης, ένα σύστημα φίλτρων (συμπεριλαμβανομένων των φίλτρων διέγερσης και των φίλτρων φραγμού), ένα οπτικό σύστημα και ένα φωτογραφικό σύστημα. Λειτουργεί χρησιμοποιώντας φως συγκεκριμένου μήκους κύματος για να διεγείρει φθορίζουσες ουσίες.
① Μέθοδοι διέγερσης φθορισμού Σύμφωνα με το εύρος μήκους κύματος του φωτός διέγερσης, υπάρχουν δύο τύποι: μέθοδος διέγερσης UV (μέθοδος υπεριώδους φωτισμού) και μέθοδος διέγερσης BV (μέθοδος μπλε-ιώδους φωτισμού). Η μέθοδος διέγερσης UV χρησιμοποιεί υπεριώδες φως μικρότερο από 400 για διέγερση. Παράγει αόρατο φθορισμό, επομένως ο παρατηρούμενος φθορισμός προέρχεται από το ίδιο το δείγμα. Αυτή η μέθοδος διακρίνει εύκολα τον συγκεκριμένο φθορισμό από τον αυτοφθορισμό του φόντου.
② Μέθοδος διέγερσης BV Η μέθοδος διέγερσης BV χρησιμοποιεί φως διέγερσης που κυμαίνεται από ιώδες έως μπλε με κέντρο στα 404 nm και 434 nm. Εφόσον χρησιμοποιείται μπλε φως για την ακτινοβολία του δείγματος, το σύστημα φίλτρου διέγερσης για αυτήν τη μέθοδο πρέπει να αποκλείει πλήρως το μπλε φως και να επιτρέπει μόνο τη διέλευση του απαιτούμενου πράσινου και κίτρινου φωτός. Για το λόγο αυτό, το σετ φίλτρου για διέγερση BV πρέπει να χρησιμοποιεί ένα φίλτρο φραγμού αποκοπής. Αυτή η μέθοδος χρησιμοποιεί μπλε φως για διέγερση, επομένως η απόδοση συλλογής φθορισμού είναι σχετικά υψηλή και μπορούν να ληφθούν πιο φωτεινές εικόνες. Το μειονέκτημά του είναι ότι ο φθορισμός πάνω από 500 nm δεν μπορεί να ανιχνευθεί και μόνο κιτρινοπράσινες εικόνες μπορούν να φανούν πάνω από 500 nm. Στη χρώση με φθορίζοντα αντισώματα, η κρίση της ειδικότητας βασίζεται σε μεγάλο βαθμό στις πληροφορίες χρώματος, επομένως το μειονέκτημα της μεθόδου διέγερσης BV μπορεί να είναι ένας σημαντικός περιορισμός όταν συζητείται η λεπτή εξειδίκευση.
